Kod жидкость: Код по ЕТСНГ «ЖИДКОСТЬ «»ИМ»»» 721225. Справочник груза ЕТСНГ

Есть потребность?
Получите лучшую цену

ТОВАРОВ | ПЦР | KOD FX Neo

ОПИСАНИЕ

KOD FX Neo основан на ДНК-полимеразе гипертермофильного Archaeon Thermococcus kodakaraensis KOD1 (1) (2).KOD FX Neo обеспечивает большую эффективность и способность к удлинению, чем обычные ферменты ПЦР. В частности, KOD FX Neo демонстрирует больший успех при амплификации неочищенных образцов.
KOD FX Neo — это улучшенная версия предыдущего KOD FX (кодовый номер KFX-101). Этот продукт содержит уникальный «усилитель удлинения», который подавляет «эффект плато», обеспечивая большую скорость и возможности удлинения.
Раствор фермента KOD FX Neo содержит два типа антител против ДНК-полимеразы KOD, которые ингибируют активность полимеразы и 3 ‘→ 5’ экзонуклеазы, что позволяет проводить ПЦР с горячим стартом (3).KOD FX Neo генерирует продукты ПЦР с тупым концом из-за своей активности экзонуклеазы 3 ‘→ 5’ (корректура).

ОСОБЕННОСТИ

• KOD -Plus-Neo демонстрирует в 80 раз большую точность ПЦР, чем ДНК-полимераза Taq.
• «Усилитель элонгации» обеспечивает большую эффективность амплификации и возможность удлинения (до 24 т.п.н. от геномной ДНК человека) по сравнению с традиционной ПЦР.
• Требуется всего 30 секунд / кб для шага расширения PCR.
• Условия двухэтапного цикла можно использовать для амплификации с использованием праймеров ≥ 20 мер (температуры плавления, Tm> 63 ° C).

ПРИЛОЖЕНИЯ

• Генотипирование (амплификация из неочищенного образца)
  Прямая амплификация из;
  — Цельная кровь, культивируемые клетки, хвост мыши, палец ноги мыши, растения и продукты питания и т. Д.
  — Различные виды лизата из хвоста мыши, растений, рыбьего плавника, почвы и т. Д.
  — грамположительные бактерии, грибки, дрожжи и т. Д.
• Эффективное усиление сложных целей (высокий G / C, длинный) в быстром режиме.
• F ПЦР высокой точности

ИСТОЧНИК

Штамм E. coli, несущий клонированный ген ДНК-полимеразы KOD

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АППАРАТА

Одна единица определяется как количество фермента, которое будет включать 10 нмолей dNTP в нерастворимый в кислоте материал за 30 минут при 75ºC.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ

50 мМ Трис-HCl (pH8.0), 0,1 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 0,001% Tween 20, 0,001% Nonidet P-40, 50% глицерин
Хранить при -20 ° C

КОМПОНЕНТЫ

Этот реагент включает следующие компоненты для 200 реакций, общий реакционный объем 50 мкл :.

* Раствор фермента содержит антитела против ДНК-полимеразы KOD, которые нейтрализуют активность полимеразы и 3 ‘→ 5’ экзонуклеаз.
** Буфер для 2x ПЦР для KOD FX Neo представляет собой жидкость (незамороженную) при хранении при -20ºC. Хотя он замерзает ниже -20ºC, на качество это не влияет.

ТИПИЧНАЯ УСТАНОВКА ДЛЯ ПЦР-РЕАКЦИИ

* Раствор фермента содержит антитела против ДНК-полимеразы KOD, которые нейтрализуют активность полимеразы и 3 ‘→ 5’ экзонуклеаз.
** Буфер для 2x ПЦР для KOD FX Neo представляет собой жидкость (незамороженную) при хранении при -20ºC. Хотя он замерзает ниже -20ºC, на качество это не влияет.

УСЛОВИЯ ЦИКЛА ПЦР

ДАННЫЕ ПО ПРИМЕНЕНИЮ

Пример 1. Увеличение длинных целей

Мишени различных размеров были амплифицированы из геномной ДНК человека с помощью нескольких ферментов ПЦР в соответствии с рекомендованными условиями для каждого фермента.KOD FX Neo успешно амплифицировал мишени размером до 40 кб.

Шаблон

Геномная ДНК человека 200 нг / 50 мкл

M: λ / Hin d III Marker
1: tPA 24kb
2: HBg 32kb
3: HBg 40kb

Пример 2 — амплификация лизатов хвоста мыши

Затем сравнивали эффективность амплификации между различными ферментами ПЦР с использованием лизатов хвоста мыши в качестве матриц.KOD FX Neo показал большую эффективность амплификации, чем другие ферменты.

Шаблон

Лизат хвоста мыши (метод щелочного лизиса) 0,25 мкл

1 ： ТАТА-бокс-связывающий белок мыши (TBP) 0,5 т.п.н.
2 ： Рецептор трансферрина мыши (Tfr) 1,5 т.п.н.
3 ： Гликопротеин мембраны мыши (Thy-1) 2,6 т.п.н.
M ： Лестница ДНК 100 п.н.

Пример 3. Амплификация из листовых образцов

Две мишени (2.2 и 4,6 т.п.н.) амплифицировали с использованием лизатов листьев табака. Каждую реакцию ПЦР проводили в соответствии с рекомендованными условиями с 35 циклами. KOD FX Neo показал большую амплификацию из лизатов, приготовленных «одностадийным методом».
Затем были непосредственно усилены различные мишени с использованием небольших кусочков табачных листьев (2 × 2 мм). KOD FX Neo успешно амплифицировал ДНК с использованием этих матриц.

Шаблон

Лизат * [Табак] 1 мкл
* Одностадийный метод

Цель

большая субъединица рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы / оксигеназы
Ген N-метилтрансферазы (rbcmtT)

Шаблон

Табачный лист (2 × 2 мм)

Цель

Ген большой субъединицы 1 рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы / оксигеназы (rbcL) 1.3 kb
2 rbcmtT 2,2 kb
3 rbcmtT 4,6 kb
M: 1 kb ДНК Ladder

ССЫЛКИ

• М. Такаги, М. Нисиока, Х. Какихара, М. Китабаяси, Х. Иноуэ, Б. Каваками, М. Ока и Т. Иманака, Характеристика ДНК-полимеразы Pyrococcus sp. штамм KOD1 и его применение для ПЦР. Appl Environ Microbiol., 63: 4504-10 (1997)
• Х. Хашимото, М. Нисиока, С. Фудзивара, М. Такаги, Т. Иманака, Т.Иноуэ и Ю. Кай, Кристаллическая структура ДНК-полимеразы гипертермофильной археи Pyrococcus kodakaraensis KOD1. J. Mol Biol., 306: 469-77 (2001)
• Х. Мидзугути, М. Накацудзи, С. Фудзивара, М. Такаги и Т. Иманака, Характеристика и применение для ПЦР с горячим стартом нейтрализующих моноклональных антител против ДНК-полимеразы KOD. J. Biochem., 126: 762-8 (1999)

Что такое кодекс EPP?

Когда у вас есть контроль над доменным именем, оно предоставляет вам несколько чрезвычайно мощных опций, таких как его продление, отмена и направление входящего трафика в выбранное вами место.Поскольку все эти изменения могут иметь долгосрочные последствия, регистраторы (такие как eNom и GoDaddy) очень серьезно относятся к безопасности. Что это значит для тебя? Если вы хотите передать домен новому регистратору, вам понадобится код авторизации от текущего регистратора, который принимает форму кода EPP.

Код EPP (или ключ EPP) — это сложный пароль, сгенерированный системой, который регистратор создаст по запросу и предоставит владельцу домена через контактный адрес электронной почты для домена в соответствии с его записью WHOIS.Это позволяет владельцу домена связаться со своим новым регистратором, который будет использовать код для подтверждения права собственности. Срок действия этих кодов обычно истекает в течение дня или двух, хотя это означает, что, если владелец не отправит запрос на передачу быстро, ему, возможно, придется получить новый код EPP и повторить попытку. Также следует отметить, что домен нельзя перенести ни в течение первых 60 дней, ни в течение 60 дней с момента предыдущего переноса.

Как я могу получить код EPP?

Запрос кода EPP — довольно простой процесс, обычно требующий всего лишь входа в систему регистратора, который в настоящее время контролирует доменное имя, которое вы хотите передать, и нажатия кнопки «Запрос кода EPP».Если вы использовали веб-хостинг для регистрации домена для вас, вам, возможно, придется открыть билет поддержки с вашим хостом, чтобы получить сгенерированный для вас код.
Для справки, вот процессы с разными регистраторами и веб-хостами. Если вы не уверены, кто в настоящее время является регистратором вашего доменного имени, вы можете выполнить поиск в WHOIS.

В Liquid Web?

Чтобы перенести доменное имя из Liquid Web, сначала войдите в свой портал управления и щелкните вкладку Домены слева:
Затем щелкните домен, который вы хотите перенести, после чего появятся подробные сведения. страница с кнопкой «Перенести этот домен» справа:

При нажатии отображается запрос на подтверждение:

Подтвердите правильность домена и адреса электронной почты регистранта, а затем нажмите «Начать постоянный перенос домена», чтобы начать.Если это было успешно, вы увидите следующее подтверждение:

После того, как вы получите электронное письмо с кодом, все готово к работе. Если вы не получили электронное письмо, обратитесь в службу поддержки Liquid Web.

На 1 и 1 IONOS?

Чтобы перенести домен из 1 & 1 IONOS, вам нужно проверить раздел Домены на панели My IONOS. Нажав на «Продление и перенос», вы сможете выбрать свой домен. Убедитесь, что параметр «Блокировка передачи домена» отключен, и когда он будет включен, нажмите «Показать код активации».«Если это не сработает, вам нужно будет связаться со службой поддержки IONOS для получения дополнительной информации.

В Dreamhost?

Чтобы перенести домен из DreamHost, вам необходимо получить доступ к своей панели и разблокировать свой домен. Проверьте раздел «Регистрации» и проверьте, отображается ли статус «Заблокировано?» показывает «Да», а затем просто щелкните слово, чтобы разблокировать его. Если отображается «нет», все готово. Если вы нажмете «Или переместить из Dreamhost», отобразится запрос генерации кода EPP. Нажмите кнопку «Показать код аутентификации», чтобы отобразить код, хотя в зависимости от TLD (домена верхнего уровня, например.com или .gov), код может потребоваться отправить по электронной почте. Если вы не получили код или электронное письмо, обратитесь в службу поддержки.

В GoDaddy?

Если ваше доменное имя в настоящее время используется GoDaddy, вам нужно будет войти в Центр управления доменом специально. Нажмите кнопку, чтобы «Управлять» рассматриваемым доменом, и прокрутите вниз до «Дополнительные настройки», где вы увидите опцию «Получить код авторизации». После нажатия этой ссылки код будет автоматически отправлен вам по электронной почте.Если этот параметр отключен, возможно, ваш домен находится в течение 60 дней с момента регистрации, ранее был перенесен или в настоящее время находится под 60-дневной блокировкой. Обратитесь в службу поддержки GoDaddy для получения дополнительной информации.

В HostGator?

Если HostGator является вашим текущим Регистратором, вам нужно получить доступ к разделу Домены на панели инструментов и щелкнуть нужный домен. Если вы нажмете на значок «замок», отобразятся параметры «Блокировка домена». Убедитесь, что ползунок «Блокировка домена» находится в положении ВЫКЛЮЧЕНО, и нажмите кнопку «Запросить ключ EPP», чтобы код стал видимым.Если у вас нет платежной учетной записи в HostGator или ваш домен не отображается, вам следует обратиться за помощью в службу поддержки HostGator.

В NameCheap?

Чтобы перенести доменное имя из NameCheap, вы сначала должны войти в свой портал управления и щелкнуть раздел «Список доменов». Выберите домен, который вы хотите передать, с помощью кнопки «Управление» и на вкладке «Совместное использование и передача» установите для параметра «Блокировка домена» значение ВЫКЛ и нажмите «Код аутентификации». Вам будет предложено указать причину переноса, но затем код будет отправлен на зарегистрированный адрес электронной почты.Если запрос не завершается или вы не получаете электронное письмо, обратитесь в службу поддержки NameCheap.

В сетевых решениях?

Если ваш домен в настоящее время зарегистрирован в Network Solutions, вам нужно будет позвонить в их службу поддержки, специально предназначенную для доменных имен, по номеру 1-888-642-0209 и запросить код EPP по телефону. Это будет отправлено зарегистрированному контакту по электронной почте.

Что мне делать с кодом EPP?

Если вы еще не начали процесс переноса домена с помощью нового регистратора или веб-хостинга, вам нужно сделать это сейчас.Это обычно обрабатывается в заявке в службу поддержки, и при запуске запроса служба поддержки запрашивает авторизацию. Просто дайте им код EPP, и регистраторы свяжутся с вами и подтвердят перенос. Вам может потребоваться продлить доменное имя, о котором идет речь, что отодвинет дату истечения срока действия, но в остальном задача завершена, и ваше доменное имя теперь должно быть в руках вашего нового Регистратора!

Рецепт быстрой капусты Kod — вегетарианские рецепты

Поваренная книга без мяса любителя мяса
Ким О’Доннел

Большинство людей считают, что вам нужно выделить часы, чтобы приготовить горшок с зеленью, и я призываю вас не делать этого поверьте шумихе.Многие из нас выросли на зеленых овощах, приготовленных до тех пор, пока их невозможно узнать, вероятно, поэтому они были такими ужасными на вкус. После обрезки жестких ребер и стеблей (которые размягчаются очень долго) листья капусты нужно всего около 30 минут в приправленной жидкости, чтобы расслабиться и заставить вас забыть о традиционной ветчине и неузнаваемых овощах прошлых лет.

Кухня Примечания: Зелень может быть песочной, и ее нужно немного промыть. Причина, по которой полоски меньшего размера, заключается в том, что капуста может готовиться быстрее (отсюда и утверждение о «быстроте»).
На 4–5 порций гарнира

ИНГРЕДИЕНТЫ

• 3 столовые ложки растительного масла
• 1 мелко нарезанная луковица среднего размера
• 2 измельченных зубчика чеснока
• 1/2 небольшого свежего перца чили на ваш выбор, с семенами и нарезанными кубиками, или 1/2 чайной ложки измельченных хлопьев красного перца (свежий даст более острый результат)
• 1 чайная ложка копченого перца
• 2 фунта зелени капусты, нарезать стебли и средние ребра и нарезать 2 х 4 дюйма полоски (около 6 чашек)
• 4 стакана воды или овощного бульона (личные фавориты — бульонные кубики Рапунцель без соли)
• Соевый соус
• Перец черный молотый
• Сидровый уксус (по желанию)

НАПРАВЛЕНИЯ

В кастрюле с толстым дном нагрейте масло на среднем огне.Добавьте лук, чеснок и перец чили и готовьте, пока лук не станет полупрозрачным, около 5 минут. Добавьте копченую паприку; это нормально, если смесь будет пастообразной.

Добавьте зелень в кастрюлю и дайте ей завянуть. Используя щипцы, переверните зелень и полейте ароматическими веществами. Добавляйте жидкость постепенно — до уровня зелени. Если зелень залита водой и у вас осталась жидкость, оставьте ее на потом, если потребуется. Доведите до активного кипения, затем уменьшите огонь и доведите зелень до готовности.

Готовьте, пока зелень не приобретет желаемую нежность. Они могут быть выполнены за 25 минут, но это нормально и до 40 минут или около того. Посмотрите, что вы думаете.

Приправить соевым соусом (постепенно добавлять и пробовать), перцем и, если используется, немного яблочного уксуса.

Исландский жидкий жир печени трески Olde World (лимонная мята), флакон 8 жидких унций (236 мл)

Саиз Хиданган: 1 чайная ложка (5 мл)

Хиданган Сетиап Бекас: 47

Бахан: Масло печени трески, натуральный вкус лимона, натуральное масло перечной мяты, альфа-токоферол.Может содержать сою.

Арахан: Взрослым принимать по 1 чайной ложке в день, если врач не посоветовал иное. После открытия хранить в холодильнике.

АМАРАН: Храните в недоступном для детей месте. Не принимайте этот продукт, если вы принимаете антикоагулянты или планируете операцию. Проконсультируйтесь с врачом перед приемом этого продукта, если вы беременны, кормите грудью, страдаете диабетом, регулярно принимаете лекарства или находитесь под наблюдением врача.

* Нилай Хариан (Д.В.) тидак дитентукан.

Ферментативный синтез модифицированных олигонуклеотидов с помощью PEAR с использованием ДНК-полимераз Phusion и KOD

Nucleic Acid Ther. 2015, 1 февраля; 25 (1): 27–34.

Кафедра биотехнологии, Колледж морских наук о жизни, Океанский университет Китая, Циндао, провинция Шаньдун, Китай.

^* Эти авторы внесли равный вклад в эту работу.

Получено 12 октября 2014 г .; Принято 6 ноября 2014 г.

Abstract

Антисмысловые синтетические олигонуклеотиды были разработаны в качестве потенциальных терапевтических средств, нацеленных на гены.Ранее мы сообщали о реакции полимеразно-эндонуклеазной амплификации (PEAR) для амплификации природных и 5′-O- (1-тиотрифосфат) (S) -модифицированных олигонуклеотидов. Здесь мы расширили технику PEAR для ферментативного получения 2′-дезокси-2′-фтор- (2′-F) и 2′-F / S дважды модифицированных олигонуклеотидов. Результат показал, что ДНК-полимераза KOD и Phusion может синтезировать олигонуклеотиды с одним или двумя модифицированными нуклеотидами, а ДНК-полимераза KOD более подходит, чем ДНК-полимераза Phusion для амплификации 2′-F и 2′-F / S дважды модифицированных олигонуклеотидов с помощью PEAR.Состав продуктов PEAR был проанализирован с помощью электрораспылительной ионизационной жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии (ESI / LC / MS) и показал, что последовательность продуктов PEAR сохраняется с чрезвычайно высокой точностью (> 99,9%), а после расщепления процент площади полноразмерных модифицированных олигонуклеотидов достигает 89,24%. PEAR подходит для синтеза модифицированных олигонуклеотидов эффективно и с высокой чистотой.

Введение

Концепция использования коротких синтетических антисмысловых олигонуклеотидов (AON) для ингибирования репликации, трансформации и трансляции вируса саркомы Рауса была впервые представлена ​​Замечником и Стивенсоном в конце 1970-х годов [1,2].AON проявляют высокую аффинность связывания с патологическими генами, вирусными нуклеиновыми кислотами или их транскриптами, чтобы индуцировать целевое молчание генов [3].

Сообщалось, что немодифицированные олигонуклеотиды очень чувствительны к расщеплению эндогенной нуклеазой в сыворотке, и их период полужизни в цельной крови мышей составляет всего около 10 минут [4]. Более того, немодифицированные олигонуклеотиды обладают некоторыми серьезными побочными эффектами; например, олигонуклеотиды, ингибирующие рост, конкурируют с олигонуклеотидами последовательности теломер человека за связывание со специфическим клеточным белком [5].Кроме того, GC-богатые олигонуклеотиды склонны к неспецифическим эффектам, таким как иммуностимулирующая активность и активация комплемента [6–10]. Следовательно, немодифицированные олигонуклеотиды могут вызывать серьезные побочные эффекты при прямом и широком применении у человека.

К счастью, антисмысловые олигонуклеотиды, модифицированные определенными подходящими химическими группами, такими как 5′-O- (1-тиотрифосфат) (S), 2′-O-метоксифенил (2′-MOE), 2′-метил (2′- OME), 2′-дезокси-2′-фтор- (2′-F) и заблокированная нуклеиновая кислота (LNA) продемонстрировали повышенную специфичность и стабильность in vivo, значительно усилили антисмысловые эффекты и уменьшили побочные эффекты по сравнению с образующимися олигонуклеотидами. [11].В последние годы появилось множество сообщений об использовании модифицированных олигонуклеотидов для генно-направленной терапии, в которых изменение альфа-фосфата и основной цепи ДНК в 2′-положении фуранозного кольца является наиболее полезным для повышения сродства и стабильности. , улучшая лечебные свойства без токсичности [11,12]. Например, Хутвагнер [13] сообщил, что AON, модифицированные 2′-метилом (OME), могут действовать как необратимые стехиометрические ингибиторы малой РНК let-7, обеспечивая эффективный и прямой способ блокировать функцию малой РНК в клетках HeLa человека и нематоды.Модифицированные олигонуклеотиды не только более эффективно связываются с нуклеиновой кислотой-мишенью [14], повышают устойчивость к эндогенной нуклеазе и снижают иммуностимулирующую активность [15]; они также способствуют доставке их в пораженные ткани, такие как спинной мозг, печень, мышцы, костный мозг, легкие, кровь и солидные опухоли [16,17].

Все время олигонуклеотиды, используемые в клинических или фундаментальных биомедицинских исследованиях, в основном происходят из химического синтеза ДНК с использованием стандартного фосфорамидитного метода [18].Однако метод химического синтеза имеет некоторые недостатки, такие как ошибки, примеси и загрязнения [19]. Хотя увеличение количества синтезируемых олигонуклеотидов и улучшение методов очистки снизило бы частоту ошибок до некоторой степени, возможности для улучшения ограничены из-за присущих химическому синтезу ограничений [20]. С другой стороны, в химическом синтезе некоторые реагенты, такие как трихлоруксусная кислота, рассматриваются как потенциальные канцерогены [21].

Чтобы преодолеть эти проблемы, ферментативная реакция может быть альтернативным или лучшим решением.Средняя частота ошибок обычной ДНК-полимеразы, такой как ДНК-полимераза Taq , составляет всего 7,2 × 10 ⁻⁵ [22], что намного ниже, чем у метода химического синтеза, частота ошибок которого достигает 3 × 10 ⁻³ [20]. А частота ошибок высокоточных ДНК-полимераз, таких как Pfu, KOD, Phusion и ДНК-полимераза Vent, даже намного ниже [23]. В ферментативных реакциях большинство реагентов, включая буферный раствор, ионы и микромолекулы, безопасны для человека и окружающей среды, а также их легко удалить.

В наших предыдущих исследованиях мы разработали метод амплификации нуклеиновых кислот, реакцию полимеразно-эндонуклеазной амплификации (PEAR), и продемонстрировали, что он подходит для ферментативного производства природных или модифицированных антисмысловых олигонуклеотидов с высокой чистотой [24,25] . Двумя наиболее популярными модификациями в области сайленсинга генов и исследования анти-мРНК являются 2′-дезокси-2′-фтор- (2′-F) и 5′-O- (1-тиотрифосфат) — (S). Как AON первого поколения, S-модификация широко использовалась в клинических исследованиях, в основном из-за их повышенной стабильности in vivo [26].Кроме того, сообщалось, что 2′-F-модификация увеличивала аффинность связывания олигонуклеотидов с последовательностями целевой РНК [27] и значительно повышала стабильность сыворотки [28]. Частичная модификация 2′-F-РНК активна во всей смысловой и антисмысловой цепях [29–31], а полностью замещенные нуклеиновые кислоты вызывают интерференцию РНК в культуре клеток млекопитающих [32]. В предыдущем исследовании мы получили олигонуклеотиды с модификациями dATPαS, dGTPαS или dCTPαS с помощью PEAR, но обнаружили, что dTTPαS не может быть эффективно включен с использованием ДНК-полимеразы Phusion [25].Чтобы получить олигонуклеотиды с более широким диапазоном модификаций, здесь мы попробовали другие ДНК-полимеразы.

Являясь термостабильными ДНК-полимеразами с высокой точностью воспроизведения, ДНК-полимераза KOD и ДНК-полимераза Phusion проявляют сильную 3 ‘→ 5’-экзонуклеазную / корректирующую активность, активность, которой не хватает в ДНК-полимеразе Taq . Более того, оба они демонстрируют превосходную технологичность и способность к удлинению, а также исключительную точность воспроизведения. Самое главное, что они оба могут синтезировать не только немодифицированную ДНК, но и модифицированную ДНК.Используя ДНК-полимеразу KOD, Кувахара сообщил о синтезе LNA-модифицированной ДНК [33]. Johannsen и др. Показали, что 2′-амино-LNA (2′-амино-LNA-TTP) может быть хорошим субстратом для ДНК-полимеразы Phusion [34].

В этом исследовании мы проверили метод PEAR для получения 2′-F-модифицированных и 2′-F / S дважды модифицированных олигонуклеотидов с использованием ДНК-полимеразы KOD и ДНК-полимеразы Phusion.

Материалы и методы

Материалы

Четыре 2′-фтор-2′-дезоксирибинуклеозид-5′-трифосфатов (2′-F-dNTP), включая 2′-F-dATP, 2′-F-dCTP, 2 ′ -F-dGTP, 2′-F-dUTP и четыре 2′-дезоксирибонуклеотида-5′-O- (1-тиотрифосфат) (dNTPαSs), включая dATPαS, dGTPαS, dCTPαS и dTTPαS, структурные формулы которых показаны на были приобретены у Trilink BioTechnologies, Inc.ДНК-полимераза KOD была приобретена у TOYOBO (Shanghai) Biotech Co., Ltd. Фьюжн-ДНК-полимераза, высокотермостабильный рестрикционный фермент PspGI и dNTP были приобретены у New England Biolabs, Inc. Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Синтетические олигодезоксинуклеотиды, включая мишень ( X ) и зонд ( P ), были синтезированы Integrated DNA Technologies, Inc. и очищены с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).Последовательность X представляет собой 5′-TGT AAA CAT CCT CGA CTG GAA G-3 ‘, который происходит из человеческой микроРНК hsa-miR-30a. Структура P представляет собой X’R’X’R’X ‘, где X ‘ и R ‘ комплементарны соответственно X и R . Последовательность P представляет собой 5′-CTT CCA GTC GAG GAT GTT TAC ACC AGG CTT CCA GTC GAG GAT GTT TAC ACC AGG CTT CCA GTC GAG GAT GTT TAC A-3 ‘, где сайт узнавания PspGI подчеркнут.

Диаграмма молекулярной структуры субстратов: (A) 2′-фтор-модифицированные дезоксирибонуклеотиды (2′-F-dNTPs) и (B) S-модифицированные дезоксирибонуклеотиды (dNTPαSs), где N представляет собой четыре различных основания: аденин, гуанин, цитозин, тимин или урацил.

реакций PEAR

реакций PEAR проводили в 96-луночном термоциклере Applied Biosystems 9700 в реакционной смеси объемом 100 мкл, содержащей по 200 мкМ каждого из dNTP, 0,1 мкМ мишени и 1,0 мкМ зонда (или «семян» PEAR продукты). Для PEAR на основе Phusion: 15 мМ трис-HCl (pH 8,0), 30 мМ KCl, 5 мМ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 2,5 мМ MgCl ₂ и 0,02% бычий сывороточный альбумин ( BSA) были добавлены; а для реакций на основе KOD реакционная смесь содержит 120 мМ трис-HCl (pH 8.0), 1 мМ MgSO ₄ , 6 мМ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 10 мМ KCl и 0,1% Triton X-100, 0,01% BSA. В желаемых реакциях один или два природных dNTP были полностью заменены соответствующими 2′-F-dNTP или dNTPαS. Концентрации ДНК-полимеразы и PspGI для различных видов модификаций показаны на. Для второго раунда PEAR условия реакции были такими же, как и в первом раунде, за исключением того, что «семена» (2 мкл продуктов PEAR) были добавлены вместо мишени и зонда.

Таблица 1.

Концентрации ДНК-полимеразы и PspGI в различных реакциях, указанные в статье

Реакции PEAR были инициированы при 95 ° C в течение 1 мин, после чего следовали 35 циклов денатурации при 95 ° C в течение 15 с, отжиг при 55 ° C в течение 35 с. , удлинение и скалывание при 75 ° C в течение 3-5 мин. Если желательно, расщепление продуктов PspGI проводили при 75 ° C в течение от 1 до 16 ч, добавляя 0,1 объема 10 × NEBuffer 4, 0,4 Ед / мкл PspGI и ddH ₂ O до 2 × объема. Продукты PEAR исследовали с помощью неденатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE) в 15% гелях при 5 В / см, окрашивали бромидом этидия и детектировали с помощью ультрафиолетового осветителя.Продукты PEAR очищали с использованием набора для очистки ДНК Oligo DNA на спин-колонке UNIQ-10 в соответствии с его протоколом для удаления ферментов, BSA и избыточных dNTP.

Масс-спектрометрический анализ продуктов PEAR, расщепленных PspGI.

Продукты PEAR были полностью расщеплены в смеси для расщепления, содержащей 1 × NEBuffer 4 и 1,0 Ед / мкл PspGI. Реакции расщепления инкубировали 8 ч при 75 ° C. До и / или после расщепления PspGI продукты очищали, как описано выше. Масс-спектрометрический анализ с ионизационной жидкостной хроматографией с электрораспылением (ESI / LC / MS) был выполнен Novatia, LLC с использованием их высокопроизводительной системы характеризации 35] для характеристики олигонуклеотидов-продуктов и профилирования компонентов.

Результаты

PEAR-амплификация 2′-F-dATP и 2′-F-dGTP модифицированных олигонуклеотидов с использованием ДНК-полимеразы Phusion

Мы использовали один или два 2′-фтор-модифицированных dNTP (2′-F-dNTP) для заменить соответствующие немодифицированные dNTP в PEAR. Результаты электрофореза PAGE показаны на. Дорожка 1 представляет собой продукты PEAR, амплифицированные с использованием немодифицированных dNTP, где серия полос ДНК представляет собой тандемные повторы мишени различной длины. Дорожка 2 представляет собой амплифицированные продукты PEAR с модификацией 2′-F-dATP вместо соответствующего нормального dATP.Как и в дорожке 1, была обнаружена серия полос ДНК, которые представляют тандемные повторы разной длины; однако, когда один из четырех dNTP, таких как dATP (дорожка 6), отсутствует, реакция PEAR полностью останавливается. Выход модифицированных продуктов PEAR зависит от количества циклов; максимальный выход модифицированных продуктов PEAR составляет около 200 нг / мкл, что аналогично выходу немодифицированных продуктов PEAR. Используя ДНК-полимеразу Phusion, PEAR может включать 2′-F-dATP и 2′-F-dGTP в продукты PEAR. Однако, как показано в, экспоненциальный PEAR был почти отменен, когда dCTP и dTTP были заменены 2′-F-dCTP и 2′-F-dUTP.

Электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE) Электрофорез продуктов реакции полимеразно-эндонуклеазной амплификации (PEAR). Строчные буквы (agct) представляют немодифицированные dNTP; заглавных букв (AGCT) представляют модифицированные dNTP (2′-F-dNTP или dNTPαS). (A) PEAR с помощью ДНК-полимеразы Phusion с использованием немодифицированных dNTP, 2′-F-модифицированных dATP и dGTP, соответственно. Дорожка 1: ДНК-лестница из 10 пар оснований; дорожка 2: нормальных dNTP; дорожка 3: продукты PEAR, модифицированные 2′-F-dATP; полоса 4: контроль без PspGI; полоса 5: контроль без ДНК-полимеразы Phusion; полоса 6: контроль без dATP; дорожка 7: лестничная клетка ДНК из 10 пар оснований; дорожка 8: продукты PEAR, модифицированные 2′-F-dGTP; полоса 9: контроль без PspGI; дорожка 10 : контроль без ДНК-полимеразы Phusion; дорожка 11: контроль без dGTP. (B) PEAR с помощью ДНК-полимеразы Phusion с использованием 2′-F-dCTP и 2′-F-dUTP. Дорожка 1: Продукты PEAR, модифицированные 2′-F-dCTP; полоса 2: контроль без PspGI; дорожка 3: контроль без ДНК-полимеразы Phusion; полоса 4: контроль без dCTP; полоса 5: лестничная клетка ДНК из 10 пар оснований; дорожка 6: продукты PEAR, модифицированные 2′-F-dUTP; полоса 7: контроль без PspGI; полоса 8: контроль без ДНК-полимеразы Phusion; полоса 9: управление без dUTP; дорожка 10: ДНК-лестница из 10 пар оснований. (C) Продукты PEAR, модифицированные 2′-F-dATP и 2′-F-dGTP, в качестве «семян» для PEAR. Дорожка 1: ДНК-лестница из 10 пар оснований; полоса 2: контроль без PspGI; дорожка 3: с использованием продуктов PEAR, модифицированных 2′-F-dATP, в качестве «семян» для PEAR; полоса 4: контроль без PspGI; , дорожка 5: с использованием продуктов PEAR, модифицированных 2′-F-dGTP, в качестве семян для PEAR. (D) 2′-F-dATP и 2′-F-dGTP модифицированные продукты PEAR с использованием ДНК-полимеразы KOD. Дорожка 1: Продукты PEAR, модифицированные 2′-F-dATP; полоса 2: контроль без PspGI; полоса 3: контроль без ДНК-полимеразы KOD; полоса 4: контроль без 2′-F-dATP; полоса 5: лестничная клетка ДНК из 10 пар оснований; дорожка 6: продукты PEAR, модифицированные 2′-F-dGTP; полоса 7: контроль без PspGI; полоса 8: контроль без ДНК-полимеразы KOD; полоса 9: контроль без 2′-F-dGTP; дорожка 10: ДНК-лестница из 10 пар оснований. (E) PEAR-амплификация продуктов, модифицированных 2′-F-dCTP и 2′-F-dUTP, с использованием ДНК-полимеразы KOD. Дорожка 1: Продукты PEAR, модифицированные 2′-F-dCTP; полоса 2: контроль без PspGI; полоса 3: контроль без ДНК-полимеразы KOD; полоса 4: контроль без dCTP; полоса 5: лестничная клетка ДНК из 10 пар оснований; дорожка 6: продукты PEAR, модифицированные 2′-F-dUTP; полоса 7: контроль без PspGI; полоса 8: контроль без ДНК-полимеразы KOD; полоса 9: управление без dUTP; дорожка 10: ДНК-лестница из 10 пар оснований. (F) PEAR-амплификация продуктов PEAR, модифицированных dTTPαS, и продуктов PEAR, модифицированных 2′-F-dATP + dGTPαS, с использованием ДНК-полимеразы KOD. Дорожка 1: продукты PEAR, модифицированные dTTPαS; полоса 2: контроль без PspGI; полоса 3: контроль без ДНК-полимеразы KOD; полоса 4: контроль без dTTPαS; дорожка 5: ДНК-лестница из 20 п.н .; полоса 6: продукты амплификации 2′-F-dATP и dGTPαS с двойным модифицированием PEAR; полоса 7: контроль без PspGI; полоса 8: контроль без ДНК-полимеразы KOD; полоса 9: контроль без 2′-F-dATP и dGTPαS; дорожка 10: ДНК-лестница из 20 пар оснований. (G) PEAR-амплификация продуктов PEAR с двойным модифицированием 2′-F-dATP + dCTPαS и 2′-F-dATP + dTTPαS с использованием ДНК-полимеразы KOD. Дорожка 1: , продукты PEAR, дважды модифицированные 2′-F-dATP + dCTPαS; полоса 2: контроль без PspGI; полоса 3: контроль без ДНК-полимеразы KOD; полоса 4: контроль без 2′-F-dATP и dCTPαS; дорожка 5: ДНК-лестница из 20 пар оснований; полоса 6: 2′-F-dATP + dTTPαS продукты амплификации с двойным модифицированием PEAR; полоса 7: контроль без PspGI; полоса 8: контроль без ДНК-полимеразы KOD; полоса 9: контроль без 2′-F-dGTP и dTTPαS; дорожка 10: ДНК-лестница из 20 пар оснований.

PEAR-амплификация олигонуклеотидов, модифицированных 2′-F-dNTP, с использованием ДНК-полимеразы KOD

Когда ДНК-полимераза KOD использовалась в PEAR вместо ДНК-полимеразы Phusion с различными типами 2′-F-модифицированных dNTP, результаты PEAR показали, что каждый из четырех 2′-F-dNTP был успешно включен в продукты PEAR ().

PEAR-амплификация модифицированных dTTPαS и 2′-F-dATP / dNTPαSs дважды модифицированных олигонуклеотидов с использованием ДНК-полимеразы KOD

В предыдущем исследовании мы сообщили, что dTTPαS не может быть включен в желаемые олигонуклеотиды с использованием ДНК-полимеразы Phusion [25].В настоящем исследовании с использованием ДНК-полимеразы KOD dTTPαS был успешно включен в продукты PEAR, как показано на дорожках 1 и 2 в. Поскольку каждый из четырех dNTPαS и четырех 2′-F-dNTP были включены в продукты PEAR отдельно, мы опробовали реакции PEAR с двумя различными типами модификации (такими как dATPαS + 2′-F-dGTP). Как показано на дорожках 6 и 7 в, ДНК-полимераза KOD обладает способностью синтезировать дважды модифицированные олигонуклеотиды, включая 2′-F-dATP + dGTPαS, 2′-F-dATP + dGTPαS и 2′-F-dATP + dGTPαS. .

Повторная амплификация PEAR с «семенами» предыдущего раунда

Преимущество PEAR в том, что продукты можно использовать в качестве семян для следующего раунда PEAR напрямую, без какой-либо обработки. В такой реакции повторной амплификации добавляли соответствующее количество продуктов PEAR для замены мишени (X) и зонда (P) и сохранения количества других веществ неизменным. Как показано на дорожке 3, при использовании продуктов PEAR, модифицированных 2′-F-dATP, в качестве затравки для реакции PEAR, дорожка 2 представляет собой контроль только с ДНК-полимеразой Phusion и без PspGI.Дорожки 9 и 10 представляют собой продукты PEAR, амплифицированные с использованием продуктов PEAR, модифицированных 2′-F-dGTP, в качестве семян.

Характеристика состава продуктов PEAR

Мы применили HP / LC / MS для анализа относительной молекулярной массы продуктов PEAR второго цикла, включенных с модификацией 2′-F-dATP ДНК-полимеразой KOD и расщепленных PspGI . Определенная молекулярная структура и состав продуктов PEAR показаны на и. Продукты PEAR в основном состоят из шести нитей, где две немодифицированные цепи являются исходным зондом (зонд B и зонд C), а другие четыре модифицированных олигонуклеотида являются продуктами PEAR.Компоненты A, D, E и F продуктов PEAR показаны в и, тогда как другие продукты показаны только в. Поскольку количество PspGI и время расщепления ограничены, некоторые из продуктов PEAR (G и H) не были полностью переварены и, таким образом, все еще содержали повторы.

ESI-LCMS-диаграмма продуктов PEAR, модифицированных 2′-F-dATP, расщепленных PspGI, компонентов (A-F) и их структур подробно показана в. R — сайт узнавания PspGI; R ‘- дополнительный сайт распознавания PspGI; X, целевая олигонуклеотидная последовательность; X ‘, дополнительная целевая последовательность.

Таблица 2.

Характеристика компонентов продуктов PEAR, модифицированных 2′-F-dATP, с помощью ионизации электрораспылением Жидкостная хроматография масс-спектрометрический анализ