Саур микс: Сауэр-микс / TypoBar.ru — Табак для кальяна во Владивостоке

Содержание

Как сделать коктейль Сауэр-микс в домашних условиях

Сауэр-миксами называют определенный тип алкогольных коктейлей, которые имеют характерный, сильно выраженный кислый вкус. Их начали готовить еще в середине девятнадцатого века, а рецепт был основан на популярных в то время —пуншах—.

Сегодня существует достаточно много вариантов приготовления этого популярного дижестива, поэтому мы подобрали для вас лучшие 10 рецептов, которые вы можете использовать для домашнего приготовления.

Рецепт коктейля «Нью-Йорк сауэр»

С помощью всего четырех ингредиентов вы сможете приготовить один из самых востребованных и известных во всем мире вариант сауэра. Яркий, свежий и бодрящий – этот микс имеет крепкую алкогольную основу, поэтому пить его лучше в конце дня.

Какие ингредиенты понадобятся

Как необходимо смешивать

Смешайте в шейкере 45 мл бурбона, 22 мл сиропа и 22 мл фреша.
Невысокий бокал наполните льдом и налейте в него эту смесь.
Сверху налейте 20 мл вина.
По желанию украсьте напиток слайсом или цедрой лимона.

Рецепт сауэр-микса «Юбилейный»

В этот варианте приготовления, как и в большинстве других, применяют как правило белковую массу яйца перепелки. Что касается алкоголя, то изюминкой этого напитка является микс —хереса— и коньяка.

Какие ингредиенты понадобятся

«Hennessy»	15 мл
«Alfonso Oloroso»	40 мл
ангостура	1 мл
фреш из лайма	10 мл
белок	25 мл
кожура апельсина	1 шт.
кожура лимона	1 шт.
кубики льда	320 г

Как необходимо смешивать

Выложите в рокс кубики льда.
Отдельно в шейкере соедините 25 мл белка, 10 мл сока, 40 мл хереса и 15 мл коньяка.
Капните туда 1 мл ангостуры.
Всыпьте оставшийся лед и хорошенько потрясите.
С помощью фильтра перелейте приготовленный микс в бокал.
Сверху украсьте цедрой, как на фото.

Рецепт коктейля «Whiskey sour»

Цитрусовые слайсы или цедра вместе с вишней для коктейля являются традиционными для приготовления сауэров. Вы можете украшать напиток на свое усмотрение либо вообще не делать этого. Главное – хорошенько взболтать смесь, чтобы появилась характерная для этих коктейлей белая пена.

Какие ингредиенты понадобятся

«Jack Daniel’s»	50 мл
сироп «Monin» (сахарный)	15 мл
ангостура	1 мл
«Vitafit Lemon»	30 мл
белок	25 мл
лимон	20 г
вишня для коктейлей	5 г
кубики льда	320 г

Как необходимо смешивать

В рокс насыпьте лед.
В шейкере смешайте 25 мл белка, 30 мл сока, 15 мл сиропа и 50 мл бурбона.
Капните 1 мл ангостуры.
Интенсивно взболтайте.
Всыпьте оставшийся лед и еще раз интенсивно взболтайте.
С помощью ситечка налейте приготовленный состав в бокал.
Для украшения используйте вишню на шпажке и лимонный слайс.

Рецепт сауэр-микса «Томми Ди»

Этот микс обладает выраженным экзотическим вкусом благодаря сиропу из маракуйи и кусочку свежего плода этого фрукта. Принцип приготовления тот же – интенсивное взбалтывание.

Какие ингредиенты понадобятся

—скотч—	50 мл
сироп из маракуйи	25 мл
«Vitafit Lemon»	30 мл
белок	25 мл
маракуйя	45 г
кубики льда	320 г

Как необходимо смешивать

В невысокий бокал насыпьте лед.
В шейкер выложите 25 мл белка, а затем налейте 30 мл сока, 25 мл сиропа и 50 мл скотча.
Переложите в него оставшийся лед и интенсивно взболтайте.
С помощью фильтра перелейте напиток в бокал.
Выложите сверху кусочек маракуйи (45 г).

Рецепт сауэр-микса «Восточный экспресс»

Этот микс действительно напоминает о востоке своими пряно-ванильными нотами. В остальном ингредиенты практически такие же, как в предыдущих миксах. Что касается виски, то односолодовый сорт будет здесь наиболее уместным.

Какие ингредиенты понадобятся

односолодовый виски	40 мл
ликер со вкусом корицы	10 мл
«Vitafit Lemon»	15 мл
ванильный сироп	20 мл
белок	25 мл
апельсин	40 г
имбирь	5 г
коктейльная вишня	5 г
кубики льда	320 г

Как необходимо смешивать

В бокал насыпьте лед до самого верха.
Отдельно в шейкере смешайте 25 мл белка, 5 г измельченного имбиря, 15 мл сока, 20 мл сиропа, 10 мл ликера и 40 мл виски.
Выложите туда лед, который остался.
Достаточно интенсивно потрясите.
Через фильтр налейте приготовленный микс в рокс.
Для украшения используйте апельсиновые дольки и вишню на шпажке.

Рецепт сауэр-микса «Ревень-ириска»

Неожиданное сочетание вкусов сладкой ириски и ревеня наверняка оценят женщины, ведь многие из них совсем не против крепкого алкоголя. Пить этот коктейль очень легко и приятно, но алкогольное опьянение может наступить довольно быстро.

Какие ингредиенты понадобятся

темный ром	30 мл
ликер со вкусом ревеня	20 мл
«Vitafit Lemon»	30 мл
ангостура	1 мл
сироп со вкусом ириски	20 мл
белок	25 мл
лимон	20 г
кубики льда	320 г

Как необходимо смешивать

Насыпьте в бокал лед.
В шейкер выложите 25 мл белка, 30 мл сока, по 20 мл ликеров и 30 мл рома.
Капните 1 мл ангостуры.
Выложите оставшийся лед и хорошенько потрясите.
Через ситечко налейте эту смесь в бокал.
Украсьте половинками лимонных слайсов.

Рецепт сауэр-микса «Кабинет»

Абсолютно мужской напиток с ярким насыщенным вкусом, ягодными нотами и крепкой алкогольной составляющей. Секрет этого микса заключается в двойном взбалтывании, поэтому не пренебрегайте этим пунктом рецепта.

Какие ингредиенты понадобятся

Как необходимо смешивать

В шейкере соедините 15 мл сока, 10 мл сиропа, 25 мл белковой массы, по 10 мл травяного и черносмородинного ликеров и 40 мл виски.
Сначала взболтайте без льда.
Добавьте 200 г ледяных кубиков и взболтайте еще раз.
С помощью ситечка налейте напиток в бокал.
Сверху накапайте 2 мл ангостуры.

Рецепт сауэр-микса «Лавандовый пирог с меренгой»

Благодаря необычным составляющим этот напиток действительно имеет вкус и аромат выпечки с нежными лавандовыми нотками. Взбалтывать необходимо очень интенсивно и не менее 1-2 минут, чтобы пена получилась достаточно плотной, как на фото.

Какие ингредиенты понадобятся

джин со вкусом лаванды	20 мл
—Limonchello—	45 мл
«Vitafit Lemon»	30 мл
сироп «Monin» (сахарный)	10 мл
белок	10 мл
лимон	20 г
корица	1 г
ледяные кубики	200 г

Как необходимо смешивать

В емкости для смешивания соедините 20 мл джина, 45 мл лимончелло, 10 мл сиропа, 10 мл белка и 30 мл сока.
Выложите туда 200 г кубиков льда.
Интенсивно взболтайте.
Перелейте полученный микс через фильтр в бокал.
Выложите сверху 1-2 лимонных слайса и посыпьте их корицей (примерно 1 г).

Рецепт сауэр-микса «Завтрак с текилой»

В основе этого коктейля используется —текила—. Кроме того, в составе этого микса используют апельсиновый джем и два вида цитрусовых соков, что делает его необычайно свежим и приятным.

Какие ингредиенты понадобятся

золотистая текила	20 мл
ангостура	2 мл
фреш из лайма	10 мл
фреш из грейпфрута	20 мл
белок	25 мл
джем из апельсина	5 г
ледяные кубики	200 г

Как необходимо смешивать

На дно шейкера выложите 5 г джема.
Сверху налейте 25 мл белковой массы, 10 мл сока лайма и 20 мл сока грейпфрута, 20 мл текилы.
Положите туда же 200 г ледяных кубиков и интенсивно потрясите.
В конце капните 2 мл ангостуры.

Рецепт сауэр-микса «Висмут»

Основные акценты в этом сауэр-миксе создают виноградный бренди, травяной ликер и мускатный орех. Обязательно приготовьте и попробуйте этот пикантный напиток, который вряд ли оставит вас равнодушными.

Какие ингредиенты понадобятся

—виноградный бренди—	50 мл
травяной ликер	25 мл
фреш из лайма	30 мл
сироп «Monin» (сахарный)	15 мл
белок	25 мл
мускатный орех	1 г
ледяные кубики	200 г

Как необходимо смешивать

В емкости для смешивания соедините 50 мл бренди, 25 мл ликера, 30 мл сока, 15 мл сиропа и 25 мл белковой массы.
Сильно потрясите емкость.
Всыпьте в нее 200 г ледяных кубиков и еще раз взболтайте.
Перелейте с помощью ситечка в бокал.
Посыпьте мускатным орехом (1 г).

Видео приготовления различных сауэр-миксов

Предлагаем вам также научиться готовить сауэр-миксы с разной алкогольной основой. Помогут вам в этом подробные видеорецепты от профессиональных барменов:

коктейль «Русский сауэр»:

коктейль «Амаретто сауэр»:

коктейль «Джин сауэр»:

Другие похожие напитки

Вы, наверное, обратили внимание на то, что основой для сауэр-миксов является крепкий алкоголь, и в большинстве случаев это различные виды виски. Поэтому мы предлагаем вам также обратить внимание на такие популярные алкогольные коктейли, как:

Это далеко не полный список вариантов приготовления сауэр-миксов, поэтому если у вас есть другие рецепты этого напитка, делитесь ими в комментариях и оставляйте свои отзывы.

Классический техасский чай рецепт | Гранд кулинар

Поделиться с друзьями:

Фотография блюда: Джон Грин

Пусть вас не вводит в заблуждение название этого напитка. Только с виду коктейль напоминает холодный чай в стакане, на самом же деле техасский чай уносит похлеще знаменитого Лонг-Айленда. В этом напитке те же ингредиенты (то есть почти весь крепкий алкоголь из бара) и бонус – виски. Смешайте всё с сауэр-миксом из лимонного сока и сахарного сиропа, плесните колы, чтобы внешне коктейль оправдал своё название, и готовьтесь к очень весёлой вечеринке!

18+ Чрезмерное употребление алкоголя вредит вашему здоровью!

Ингредиенты к рецепту:

Сауэр-микс

30 мл. лимонного сока
15 мл. простого сахарного сиропа, рецепт см. ниже

Классический техасский чай

15 мл. водки
7 мл. джина
7 мл. рома
15 мл. текилы
15 мл. виски
15 мл. трипл сек
Немного колы

Простой сахарный сироп

1 ст. сахара
1 ст. воды

Приготовление блюда по рецепту:

Сауэр-микс:
Смешайте в стакане лимонный сок и сахарный сироп.
Техасский чай:
Наполните бокал Коллинз льдом. Влейте водку, джин, ром, текилу, виски, трипл сек и 30 мл. сауэр-микса. Долейте колы.

Перемешайте один раз барной ложкой и подавайте. Украшать бокал не надо.
Простой сахарный сироп:
Положите сахар и воду в небольшую кастрюлю. Нагрейте на слабом огне, помешивая, пока сахар не растворится. Или же нагрейте в микроволновой печи. Храните, закрыв крышкой, в холодильнике.

Категории:

Сироп Sauer Mix — Коктейльная карта

Водка – 60 мл
клубничый ликер – 60 мл
смесь Sweet an Sour mix – 30 мл
апельсиновый сок – 30 мл

Соединить ингредиенты в смесительном стакане со льдом и размешать. Подавать в стакане коллинз.

водка – 35 мл
ананасовый сок – 60 мл
смесь сауэр – 120 мл
ананас – 1 ломтик

Соединить ингредиенты в смесительном стакане со льдом и размешать. Подавать в стакане коллинз, украсив фруктом.

ликер Amaretto – 7 мл
ликер Creme de Noyaux – 7 мл
ликер Grand Marnier – 7 мл
легкий ром – 20 мл
ликер Southern Comfort – 7мл
водка – 20 мл
ананасовый сок – 15 мл
смесь сауэр – 15 мл

Смешать все в шейкере со льдом и хорошо сбить. Процедить в стакан хайбол и добавить лед.

водка – 30 мл
напиток 7-UР – 1 раз плеснуть
апельсиновый сок – 45 мл
смесь сауэр – 45 мл

Соединить ингредиенты в смесительном стакане со льдом и размешать. Подавать в стакане хайбол.

03 Ноя

Рубрики: Водка, Сироп Sauer Mix

водка – 30 мл
смесь сауэр – 90 мл
лимон – 1 твист

Соединить ингредиенты в смесительном стакане со льдом и размешать. Подавать в стакане хайбол.

ликер Triple Sec – 15 мл
водка – 30 мл
cмесь сауэр – 45 мл
лайм – 1 долька

Смешать все в шейкере со льдом и хорошо сбить, затем процедить в бокал для коктейля и украсить фруктом.

абрикосовое бренди – 30 мл
ликер Triple Sec – 20 мл
водка – 30 мл
смесь сауэр – 60 мл

Смешать все в шейкере со льдом и хорошо сбить. Процедить в стакан хайбол и добавить лед.

ликер Southern Comfort – 15 мл
водка – 45 мл
гранатовый сироп – 15 мл
апельсиновый сок – 45 мл
смесь сауэр – 45 мл

Смешать все в шейкере со льдом и хорошо сбить. Процедить в стакан коллинз и добавить лед.

Бренди Courvoisier – 50 мл
ликер Apricot Brandy – 25 мл
Сауэр Микс – 25 мл

Готовится в шейкере, бокал – коктейльная рюмка.

Ром Bacardi (светлый) – 50 мл
Сауэр Микс – 25 мл
ликер Creme De Banana – 25 мл
свежий банан – 1/4

Готовится в блендере, подается в шампанском блюдце. Украшается долькой лимона, кусочком банана, 2 короткими соломинками.

Ром Бакарди – 35 мл
гранатовый сироп – 7мл
смесь сауэр – 120 мл.

Смешать все в шейкере со льдом и хорошо сбить. Процедить в стакан и добавить лед

Водка – 30 мл,
ликер Blue Curacao – 60 мл,
ананасовый сок – 60 мл,
смесь сауэр – 60 мл.
Приготовление: Смешать в шейкере все, кроме Curacao, со льдом и хорошо сбить. Процедить в стакан коллинз, добавить лед и сверху налить слоем Curacao.

Ликер Бенедиктин (Benedictine D.O.M.) – 1 1/2 чайной ложки,
вишневое бренди Черри Бренди – 1 1/2 чайной ложки,
водка – 45 мл,
бальзам Angostura Bitters – 3-5 капель,
содовая вода – 7 мл,
смесь сауэр – 30 мл.
Приготовление: Смешать в шейкере все, кроме содовой, со льдом и хорошо сбить. Процедить в стакан хайбол, добавить содовую и лед.

Сиропы для коктейлей или коктейли для сиропов?

В прошлой статье «Сироп в коктейлях. Откуда, зачем и почему» мы рассказали вам о, без ложной скромности, ключевой роли сиропа (в частном случае – сахара) в коктейльной истории и вкратце намекнули о существовании неких магических формул, понимая (именно понимая, а не выучив!) которые можно очень быстро освоить рецептуры большого количества коктейлей и приобрести знания о том как делать новые коктейли из новых ингредиентов. С первой попытки. Вот об этом сегодня и поговорим.

Родина коктейля – Америка и принято считать, что именно Соединённые Штаты (конечно, не без помощи Европы) сделали коктейль тем, чем он является сегодня – популярным смешанным напитком, имеющим богатую историю длиною немногим более двух столетий. И именно на иностранных языках, к сожалению, издана большая часть коктейльной литературы.

Однако те формулы, о которых мы будем говорить сегодня, выведены (точнее – вышли в печать) ещё в 1978 году в СССР господином Кудрявцевым, который, к слову, в 2016 году получил профессиональную барную премию Барометр за вклад в индустрию.

Коснувшись истории смешанных напитков и её отображения в нашей стране, нельзя не отметить, что в настоящий момент Россия считается одной из сильнейших «кузницей кадров» профессиональных барменов – наши ребята являются финалистами всех престижных международных конкурсов, пионеры российского барного движения известны коллегам по всему миру, а их заведения входят в списки лучших баров мира по версиям зарубежных изданий, чьи компетенции не вызывают вопросов.

Итак, вернёмся к книге «Технология приготовления смешанных напитков» А.Г. Кудрявцева и рассмотрим, для начала, такой тип коктейля, как «сауэр». В общем виде под коктейлем-сауэром подразумевается смесь крепкого алкоголя, кислой и сладкой части. При этом за кислую часть обычно отвечает лимонный сок или сок лайма, а за сладкую – сироп.

В простейшем случае – сахарный – в равных пропорциях сахара и воды.

А ещё готовую (для удобства бармена) смесь кислой и сладкой части называют сауэр-микс

Вот что пишет в своём учебном пособии Кудрявцев на тему сауэров:

«Сауэры … состоят из смеси цитрусовыхсоков, сахара или других подслащивающих компонентов и алкогольного основания … Условная формула классического сауэра выглядит следующим образом: а+2в+7с, где а — подслащивающий компонент; в — кислая часть; с – база».

Т.е. купив сиропы для коктейля, вы, используя эту заветную формулу сможете легко приготовить как классический виски-сауэр, смешав (для 100 мл напитка) 10 мл сахарного сиропа, 20 мл лимонного фреша и 70 мл виски, так и немыслимое количество твистов (вариаций) на этот коктейль. Для этого достаточно лишь заменить сахарный сироп на, скажем, ореховый. Или медовый. Или фруктовый. Множество комбинаций может подарить вам также замена в кислой части сока лимона на сок лайма или на сок другого цитрусового плода. Подходят также ингредиенты, содержащие не только лимонную кислоту, но, скажем, яблочную.

Однако такие вариации Кудрявцев называет уже «сау» и добавляет, что при приготовлении сау-коктейлей можно также использовать ароматические модификаторы и эмульгаторы. В роли последнего обычно успешно выступает белок яйца, не меняющий вкуса коктейля, но придающий ему «шелковистость» и мягкость.

Запомните главное: две кислых части, одна – сладкая и алкоголь. И разные сиропы для коктейля, конечно.

В общем, всё, что вам нужно для приготовления большого количества самых разных коктейлей по приведённой выше простой формуле – это ограниченное количество алкогольных напитков (можете начать с базовых: джина, водки, рома и виски) и много сиропов для коктейлей. Разнообразных сиропов, с которыми вы сможете экспериментировать не только по части коктейлей, но и добавлять их в чай, кофе, поливать мороженое и снова возвращаться к прекрасному миру сауэров.

Выбрать и купить сироп для коктейлей вы можете в разделе «где купить». Или свяжитесь с нашими менеджерами для получения условий оптовых поставок сиропов в бары, рестораны, кафе или магазины

Sweetfill. Потому что мы чтим традиции сироповарения.

Коктейли :: Ресторан Баку

Состав:

Ванильная водка, клюквенный морс, сок лайма, Триплеек

Состав:

Ром, лайм, мята, сахар, содовая.

Состав:

Ром, сок ананасовый, кокос, сливки.

Состав:

Апероль, содовая, шампанское, апельсин.

Состав:

Ром, водка, текила, триплс сек, джин, сауэр микс, кола.

Состав:

Ром, сахар, лайм.

Состав:

Скотч, амаретто, лайм.

Состав:

Джин, малина, лайм, белок.

Состав:

Водка, кофейный ликер, сливки.

Состав:

Джин, сладкий вермут, кампари.

Состав:

Водка, мандариновый сок, фалернум, лаймовый фреш, тросниковый сахар.

Состав:

Бурбон, мед, сок лайма, сок апельсина, белок.

Состав:

Бакарди супериор, ликер какао, миндальный сироп, сок лайма, содовая.

Состав:

Водка финляндия редбери, сироп ваниль, сок лайма.

Состав:

Текила серебро, морковный сок, сироп агава, сок лайма, сироп спайси.

Состав:

Ликер персик, куантро, шампанское, содовая.

Состав:

Джин, имбирь, яблочный ликер, сок лайма, сахар.

Состав:

Джин, сироп ибискус, лаймовый фреш, куантро.

Состав:

Джек Дэниелс, ягермейстер, бузина.

Состав:

Ликер какао, ликер дыня, сливки.

Состав:

Ром, ликер яблоко, лимонный фреш, сахар.

Состав:

Ликер кофе, ягермейстер, лимон, клюквенный сироп.

Состав:

Три коктейля Б-52

Калорийность Коктейль, виски сауэр, микс, бутилированный. Химический состав и пищевая ценность.

Химический состав и анализ пищевой ценности

Пищевая ценность и химический состав

«Коктейль, виски сауэр, микс, бутилированный».

В таблице приведено содержание пищевых веществ (калорийности, белков, жиров, углеводов, витаминов и минералов) на 100 грамм съедобной части.

Нутриент	Количество	Норма**	% от нормы в 100 г	% от нормы в 100 ккал	100% нормы
Калорийность	87 кКал	1684 кКал	5.2%	6%	1936 г
Белки	0.1 г	76 г	0.1%	0.1%	76000 г
Жиры	0.1 г	56 г	0.2%	0.2%	56000 г
Углеводы	21.4 г	219 г	9.8%	11.3%	1023 г
Вода	78.2 г	2273 г	3.4%	3.9%	2907 г
Зола	0.2 г	~
Витамины
Витамин В1, тиамин	0.013 мг	1.5 мг	0.9%	1%	11538 г
Витамин В2, рибофлавин	0.01 мг	1.8 мг	0.6%	0.7%	18000 г
Витамин В4, холин	0.9 мг	500 мг	0.2%	0.2%	55556 г
Витамин В5, пантотеновая	0.013 мг	5 мг	0.3%	0.3%	38462 г
Витамин C, аскорбиновая	2.7 мг	90 мг	3%	3.4%	3333 г
Макроэлементы
Калий, K	28 мг	2500 мг	1.1%	1.3%	8929 г
Кальций, Ca	2 мг	1000 мг	0.2%	0.2%	50000 г
Магний, Mg	1 мг	400 мг	0.3%	0.3%	40000 г
Натрий, Na	102 мг	1300 мг	7.8%	9%	1275 г
Сера, S	1 мг	1000 мг	0.1%	0.1%	100000 г
Фосфор, P	6 мг	800 мг	0.8%	0.9%	13333 г
Микроэлементы
Железо, Fe	0.11 мг	18 мг	0.6%	0.7%	16364 г
Селен, Se	0.4 мкг	55 мкг	0.7%	0.8%	13750 г
Цинк, Zn	0.07 мг	12 мг	0.6%	0.7%	17143 г
Усвояемые углеводы
Моно- и дисахариды (сахара)	21.4 г	max 100 г
Насыщенные жирные кислоты
Насыщеные жирные кислоты	0.008 г	max 18.7 г
16:0 Пальмитиновая	0.008 г	~
Мононенасыщенные жирные кислоты	0.002 г	min 16.8 г
18:1 Олеиновая (омега-9)	0.002 г	~
Полиненасыщенные жирные кислоты	0.02 г	от 11.2 до 20.6 г	0.2%	0.2%
18:2 Линолевая	0.013 г	~
18:3 Линоленовая	0.005 г	~
Омега-3 жирные кислоты	0.005 г	от 0.9 до 3.7 г	0.6%	0.7%
Омега-6 жирные кислоты	0.013 г	от 4.7 до 16.8 г	0.3%	0.3%

Энергетическая ценность Коктейль, виски сауэр, микс, бутилированный составляет 87 кКал.

fl oz = 32.3 гр (28.1 кКал)
2 fl oz = 65 гр (56.6 кКал)

Основной источник: USDA National Nutrient Database for Standard Reference. Подробнее.

** В данной таблице указаны средние нормы витаминов и минералов для взрослого человека. Если вы хотите узнать нормы с учетом вашего пола, возраста и других факторов, тогда воспользуйтесь приложением «Мой здоровый рацион».

Cuba libre

Cuba Libre 290 ₽

Светлый ром, пепси, лайм.

Paul Gauguin 400 ₽

Домашний пряный ром, светлый ром, пюре маракуйи.

Bloody Mary 390 ₽

Водка, лимонный сок, томатный сок, тобаско, ворчестер, оливки, малосольные огурцы, молотый перец.

Old Fashioned 390 ₽

Jim Beam, ароматик биттер, тростниковый сахар.

Lynchburg Lemonade 450 ₽

Jack Daniel’s, апельсиновый ликер, лимонный сок, 7UP.

Zombie №2 450 ₽

Домашние темный и пряный ром, светлый ром, грейпфрутовый сок, ликер Maraskino, гренадин, ароматик биттер, сок лайма, абсент.

Mai-Tai 450 ₽

Светлый ром, ликер Dry Orange, миндальный сироп, лимонный сок, ананасовый сок, ароматик биттер, домашний темный ром.

Bacardi Mojito 350 ₽

Bacardi Carta Blanco, лайм, мята, сахарный сироп, содовая, мята.

Millenium 450 ₽

Домашние темный и пряный ром, светлый ром, джин, текила, апельсиновый ликер, пюре маракуйи, сироп корицы, гренадин и игристое вино.

Planter’s Punch 400 ₽

Домашний темный ром, светлый ром, гренадин, миндальный сироп, ликер Dry Orange, лимонный сок, ананасовый сок, апельсиновый сок.

Pink Berry Sour 350 ₽

Водка Finlandia Nordic Berries, пюре малины, сауэр микс.

Glentwine 350 ₽

Домашнее красное вино, настоянное на специях и фруктах, лимонный сок, мед.

Bacardi Cuba Libre 350 ₽

Bacardi Carta Oro, пепси, лайм.

Prince of Persia 350 ₽

Джин, ликер Лимончелло, сливки, фисташковый сироп.

Smoky Sour 450 ₽

Auchentoshan American Oak, Laphroaig 10 y.o., пюре маракуйи, сахарный сироп, белок.

Hello, Honey 450 ₽

Jack Daniel’s Honey, лайм, игристое вино, сахарный сироп

Moscow Mule 390 ₽

Водка Tundra, Ginger Ale, лайм, имбирный сок, сахарный сироп

Experiment №2 350 ₽

St-Germain ликёр, водка, яблоко, базилик, лимонник, лимонный сок, сахарный сироп

Sacher 350 ₽

Сливочный ликер, темный какао ликер, кофейный ликер, сливки.

Sweet Havana 350 ₽

Домашний темный ром, черносмородиновый ликер, сливки, гренадин, черника.

Sex on the Beach 400 ₽

Водка, ананасовый сок, клюквенный сок, персиковый ликер.

Pina Colada 400 ₽

Светлый ром, кокосовое молоко, сливки, ананасовый сок, ликер Malibu.

Singapore Sling 400 ₽

Джин, ананасовый сок, ликер Cherry Brandy, лимонный сок, апельсиновый ликер, Benedictine, гренадин, ароматик биттер, содовая.

June Bug 400 ₽

Malibu, банановый ликер, лимонный сок, дынный сироп, ананасовый сок, вейдж ананаса.

Key Pop Island 400 ₽

Вишневый сироп, ликер Blue Curacao, лимонад, Long Island mix.

Long Island From Odessa 450 ₽

Водка, настоянная на вишне чернике и клюкве, ежевичный ликер, черносмородиновый ликер, дынный ликер, ананасовый сок, морс.

Mermaid 450 ₽

Ликер Блю Кюрасо, ликер зеленой дыни, виски Cкотч, яблочный сок, апельсиновый сок, Ginger Ale.

Long Island Iced Tea 450 ₽

Светлый ром, водка, джин, текила, апельсиновый ликер, лимонный сок, сахарный сироп, пепси.

Cranberry Iced Tea 450 ₽

Домащняя Текила на халапенье, светлый ром, дынный ликер, дынный сироп, сироп маракуйи, апельсиновый и ананасовый сок.

Purple Passion Tea 450 ₽

Водка, черносмородиновый ликер, светлый ром, джин, лимонный сок, лимонный тоник.

Grapefruit Pomgrosmo 350 ₽

Водка Finlandia Grapefruit, гранат, лимонный сок, ванильный сироп.

Martini Tonic 350 ₽

Martini Bianco, тоник, лайм.

Martini Fiero Tonic 350 ₽

Martini Fiero, Tonic, апельсин

Aperol spritz 390 ₽

Aperol, игристое вино, содовая, апельсин.

Pink Sangria 350 ₽

Белое чилийское вино, настоянное на фруктах и специях, сироп розы, содовая

Gregory 250 ₽

Сироп бузины, ликер зеленый банан, лимонный сок, Absolut Pears, виноград.

Antonio 250 ₽

Фисташковый сироп, ликер ежевики, клюквенный морс, домашний пряный ром.

B-52 270 ₽

Кофейный ликер, апельсиновый ликер, сливочный ликер.

Clouds 250 ₽

Самбука, Текила, сливочный ликер, ликер blue curacao, абсент.

Gregory №2 250 ₽

Банановый ликер, дынный ликер, лимонный сок, Порто, виноград.

Barbarisca 250 ₽

Клубничный сироп, банановый ликер, Absolut Vanalia, кумкват.

Chi-Wa-Wa 250 ₽

Текила, настоянная на халапенье, апельсиновый ликер, жженный сахар.

Quattroporte 250 ₽

Ежевичный ликер, персиковый ликер, домашний пряный ром, кумкват.

Gold Strike Shot 250 ₽

Персиковый и апельсиновый ликеры, лимонный сок, ликер корицы

Belochka 250 ₽

Сироп фундука, ликер темный какао, сливочный ликер, тертый шоколад.

Flaming Lamborghini 250 ₽

Самбука, ванильный ликер, ликер Blue Curacao, сливочный ликер, сироп гренадин.

C-17 250 ₽

Апельсиновый ликер, ликер Galliano, темный ром

Green Mexican 250 ₽

Ликер Pisang, лимонный сок, текила, настоянная на халапенье.

Virgin Mary 250 ₽

Томатный сок, лимонный сок, тобаско, ворчестер, молотый перец, кисло-сладкий соус Чили

Mojito N/A 250 ₽

Мята, лайм, сахарный сироп, содовая, мята.

Здоровье 250 ₽

Банан, клубничный кордиал, грейпфрутовый и апельсиновый соки, клубничный сироп

Morning Breakfast 250 ₽

Йогурт, клубничный и малиновый кордиал, банан, сироп клубники

Vegetable Garden 250 ₽

Базилик, яблоко, лимонник, сахар, лимонный сок, содовая

Strawberry/Raspberry Lemonade 250 ₽

Клубничный или малиновый кордиал на ваш выбор, содовая

Ginger&Strawberry Lemonade 250 ₽

Имбирный сок, клубничный кордиал, содовая

Red Dress Hot N/A 250 ₽

Апельсин, малиновый кордиал, мед, клюквенный морс

Daiquiri 350 ₽

Светлый ром, лимонный сок, сахарный сироп, лайм.

White Russian 350 ₽

Водка, кофейный ликер, сливки.

Caipirinha 350 ₽

Лайм, кашаса, сахарный сироп.

Cosmopolitan 350 ₽

Absolut Citron, апельсиновый ликер, клюквенный сок, лимонный сок.

Apple Tini 350 ₽

Домашняя водка, настоянная на специях, яблоке и груше, сахарный сироп, лимонный сок, яблоко.

Whiskey Sour 350 ₽

Бурбон, саур-микс, ароматик биттер, цедра лимона и коктейльная вишня.

Va-Va-Voom 350 ₽

Водка, настоянная на специях, яблочный сок, пюре маракуйи, сахарный сироп, сироп маракуйи, мята, содовая.

Manhattan 350 ₽

Виски Бурбон, Martini Rocco, ароматик биттер.

Negroni 350 ₽

Джин, Martini Rosso, Кампари, апельсин.

Dry Martini 350 ₽

Джин, Martini Extra Dry, оливки.

Clover Club 350 ₽

Джин, Martini Extra Dry, пюре малины, сауэр микс.

Margarita 350 ₽

Текила, настоянная на халапенье, сахарный сироп, апельсиновый ликер, лимонный сок, белок яйца, соль, лайм.

МоскваСанкт-ПетербургЯрославль

масляных красок и медиумов — Jill Saur Fine Art

Масляные краски и наполнители Джилл Заур

Масляная краска сохнет намного медленнее, чем любой другой материал для рисования. Эта среда требует терпения. Однако, в конце концов, если все сделано правильно, картина маслом чрезвычайно полезна.

Winsor & Newton Oil Products

Масляные краски Winsor & Newton

В 1832 году Генри Ньютон и Уильям Винзор основали компанию Winsor & Newton.Они известны производством высококачественных красок и материалов. Этими масляными красками я работаю всю жизнь.

Winsor & Newton Oil Mediums

Winsor & Newton Liquin Original — Полуглянцевая среда, ускоряющая высыхание и улучшающая растекание краски. Эта среда вдвое сокращает время высыхания масляной краски (в зависимости от толщины краски). Эта среда также противостоит пожелтению. Однако использование слишком большого количества этого средства может вызвать растрескивание краски при высыхании.

Стандартная масляная живопись, средний

Когда вы выдавливаете масляную краску прямо из тюбика, она состоит из двух частей: пигмента (цвет) и среды (масла). Разные цвета и марки имеют разную консистенцию краски. В общем, масляная краска сама по себе является густой краской и плохо смешивается с другими красками. Когда вы наносите краску прямо из тюбика на кисть, она часто оказывается слишком густой для рисования. Использование небольшого количества среды для рисования разбавит краску до нужного вам места, чтобы смешать ее с другой краской или нанести на кисть и создать красивые мазки на картине.

Изготовление масляной живописи Материал: Для создания масляной живописи вам понадобятся два ингредиента; 1/3 льняное масло стоячое до 2/3 скипидар . Я перечислил эти два ингредиента ниже. Смешайте эти ингредиенты в банке с закрытой крышкой. Не забудьте погуглить, как безопасно утилизировать тряпки, которыми вы сушите кисти. Тряпки, смоченные в среде для рисования, могут легко воспламеняться в мусорном ведре!

Первый ингредиент для масляной живописи Средний:

Winsor & Newton Artists ‘Painting Medium — Это льняное масло / нефтяной дистиллят, используемый для разжижения консистенции масел и алкидов.Эта среда при высыхании превращается в гибкую пленку с минимальной тенденцией к пожелтению, образованию складок и растрескиванию.

Второй ингредиент для масляной живописи Средний:

Дистиллированный скипидар Winsor & Newton — Растворители различаются по своей способности «разрыхлить» основу масляной краски. Самый мощный растворитель — это дистиллированный скипидар. Он медленно испаряется, а также является наиболее опасным и пахнущим растворителем, используемым масляными художниками.Используйте это только в проветриваемых помещениях!

Winsor & Newton Liquin Impasto — Полуглянцевая, быстросохнущая, не желтеющая среда Impasto, сохраняющая текстуры и мазки кисти без видимого выравнивания. Эта среда увеличивает объем краски и дает больше времени на растушевку. Используйте эту среду для интенсивной работы кистью или мастихином. Эту среду можно использовать в соотношении 50/50.

Winsor & Newton Artists ‘Oil Color Artists’ Gloss Varnish — Этот продукт представляет собой финальный лак для масляных и алкидных картин, которые были тщательно высушены (не менее 6-12 месяцев).Этот лак обеспечивает превосходную защиту от грязи, жира и ультрафиолетовых лучей. Есть три формулы с разной степенью блеска. Я использую глянцевый лак . Вы можете предпочесть другой. Gloss Varnish — это не желтеющий лак общего назначения. Высыхает до зеркального блеска. Вы можете смешать это с матовым лаком, чтобы получить различную степень блеска, которую вы предпочитаете. Если вы нанесете лак на картину до того, как она высохнет, вы запечатнете влагу, и краска со временем начнет трескаться.Убедитесь, что ваша картина высохла!

Если вы хотите использовать временный лак до того, как ваша картина полностью высохнет, я предлагаю вам использовать лак для повторного прикосновения, такой как Grumbacher Damar Retouch Varnish . Это лак-спрей Damar для использования на промежуточных этапах масляной живописи, чтобы выровнять блеск незавершенных работ. Этот лак также можно использовать для защиты картин перед окончательной лакировкой. Лак прозрачный, быстросохнущий, глянцевый.Дайте ему полностью высохнуть, прежде чем перекрашивать. Используйте этот продукт только тонкими слоями. Этот продукт не предназначен для использования в качестве финального лака.

Winsor & Newton Oil Products

Масляные краски M. Graham

Художник, Арт Грэм, имел многолетний опыт работы в других компаниях, когда он разветвился самостоятельно и основал свою собственную компанию.Его продукция основана на его собственных высоких стандартах и ценностях. Я имел дело непосредственно с семьей Грэхем и испытывал к ним огромное уважение и их изысканные краски. Их краска изготавливается без наполнителей и добавок. Они создают эти прекрасные художественные масла небольшими партиями. Каждый цвет богат и насыщен с максимально возможной тонирующей способностью и оттенком. Мастера эпохи Возрождения, такие как Да Винчи и Дюрер, предпочитали масло грецкого ореха льняному маслу. Арт Грэм использует масло грецкого ореха в качестве связующего для всех своих красок.Он течет свободно и менее склонен к пожелтению и растрескиванию.

Избегайте агрессивных растворителей с маслом грецкого ореха M. Graham

Масло грецкого ореха удаляет краску с кистей художника. Это натуральное растительное масло, которое не испаряется. Добавление масла грецкого ореха в краску, выдавленную непосредственно из тюбика, замедлит время высыхания и улучшит растекание краски. Это также увеличит блеск. Я рекомендую студентам попробовать использовать это в качестве единственного средства рисования кистью.Скипидар — агрессивный растворитель и токсичен для здоровья. Скипидар был изобретен в индустриальную эпоху, намного позже великих мастеров масляной живописи. Великие мастера использовали только масло грецкого ореха, чтобы очистить кисти и усилить растекание краски!

Масляные краски художников Рембрандта

Художественные масляные краски Рембрандта производятся в Голландии. Они изготовлены по высочайшим стандартам качества и имеют маслянистую нотку.Их интенсивность цвета не имеет себе равных, потому что они используют дорогие чистые пигменты. Пигменты очень тонко измельчаются в связующем из чистейшего льняного или сафлорового масла. Все это приводит к тому, что краска становится гладкой, кремообразной и очень равномерно ложится на холст. Обожаю эти краски!

Водорастворимые масла M. Holbein Duo Aqua

Поскольку эти краски моются мылом и водой вместо агрессивных растворителей, Duo Aqua Oil Colors более безопасны, чем обычные традиционные масляные краски при использовании в студии.Эти краски были разработаны для обеспечения такого же высокого качества пигмента и архивных свойств, как у обычных масел, при этом позволяя очищать мыло и воду. Эти краски обладают насыщенными оттенками, высокой интенсивностью цвета, отличной светостойкостью и прекрасной цветовой гаммой! Эти краски можно разбавлять водой, и они сохнут быстрее, чем традиционные масла. Эти краски можно смешивать с акриловыми красками, акварельными красками, гуашью и маслами для создания различных эффектов. Однако эти краски больше не растворяются в воде при смешивании с более чем 30% традиционного масляного красителя.

Если вы хотите рисовать мастихином с использованием этих красок, вы можете использовать Winsor & Newton Artisan Water Mixable Oil Impasto Medium . Эта среда загущает смешиваемые с водой масла для текстурированной живописи, а также сокращает время высыхания. Всегда тщательно смешивайте эту среду с краской.

Палитра Masterson Sta-Wet Palette Seal: Я люблю рисовать маслом с помощью палитры Masterson Sta-Wet Palette Seal.Эта специализированная палитра сохраняет краску влажной, продлевая срок службы вашей живописи. С закрытой крышкой краска останется красивой и свежей! В комплекте несколько листов палитры. Вам придется покупать больше бумаги отдельно.

Асимметричная экспрессия генов SAUR, опосредованная ARF7 / 19, способствует гравитропизму и фототропизму растительных гипокотилей

Основные моменты

•

Гравитация запускает асимметричную экспрессию генов семейства SAUR

02000

0 7209 7909 в соевых бобах. Гены подсемейства SAUR19 асимметрично экспрессируются в гипокотилях Arabidopsis в тропизмах

•

Гены подсемейства SAUR19 имеют решающее значение для экспрессии гипокотилей гравитрофного и фототропного

ARF 9207 9207 • ARF • ARF Гены подсемейства SAUR19

Резюме

Асимметричное распределение ауксина приводит к изгибающемуся росту гипокотилей во время гравитропных и фототропных ответов, но сигнальные события после ауксина остаются неясными.Здесь мы идентифицируем множество генов SAUR , демонстрирующих асимметричную экспрессию в гипокотилях сои во время гравистимуляции, а затем изучаем их гомологи в Arabidopsis . Гены подсемейства SAUR19 обладают асимметричной экспрессией в гипокотилях Arabidopsis во время гравитропных и фототропных ответов, вызванных латеральным перераспределением ауксина. Как мутация генов подсемейства SAUR19 , так и эктопическая экспрессия SAUR19 ослабляют эти тропические ответы, указывая на критическую роль их асимметричной экспрессии.Ауксин-чувствительный фактор транскрипции ARF7 может напрямую связываться с промотором SAUR19 и асимметрично активировать экспрессию SAUR19 в тропических ответах. Взятые вместе, наши результаты показывают, что вызванное гравитацией или светом асимметричное распределение ауксина индуцирует асимметричную экспрессию генов подсемейства SAUR19 с помощью ARF7 и ARF19 в гипокотилях, что приводит к изгибному росту во время гравитропных и фототропных ответов.

Ключевые слова

гравитропизм

фототропизм

SAUR

ARF

ауксин

асимметричный

SAUR19

ARF7

SAUR19

ARF7

00020002 Arabidopsis

Bean

с).

Цитирующие статьи

Загрузить Lagu Saur Get (5,52 МБ) (04:01)

Скачать Lagu Saur, Sahur-Sahur (Manggis Error) версия Koplo Patrol, Koplo Time, 5,52 МБ, 04:01, PT4M1S, 3,881,670, 32,196, 3,153, 2020-04-29 08:35:52, 2021-05-09 10 : 40: 28, скачать + lagu + saur, руководство Afcind, manual.afcind.com

Оригинальная песня Пемуды Креатифа Манггиса Ошибка youtube.com/watch?v=fmGPECN0JDY Lebih baik didengarkan menggunakan…

Спасибо за просмотр:) Ассаламуалайкум👋👋 √ КАК √КОМЕНТ √ ПОДЕЛИТЬСЯ √ ПОДПИСАТЬСЯ 1 Подписаться 1000 Pahala Aminn🙏 Kejar 1000 Подписаться🙏Mohon dukunganyla …

вирусного тербару !!! лагу сахур 3 ирама, пемуда аче багункан сахур !!!!! пемуда компак

Слушайте песню Скачать

#aceh #indonesia #malaysia #bangunkansahur #brunai

Kentrung

ENY SAGITA — DJ ANGKLUNG SAHUR — SAHUR (АЙО КИТА САХУР) ДЖУДУЛ: САХУР — САХУР (АЙО КИТА САХУР) ВОКАЛ: ENY SAGITA VERSI DJ ANGKLUNG Лирик Лагу…

БЕСПЛАТНЫЙ ОГОНЬ БАНГУНКАН САХУР .. Перхатян !! видео Ini Saya Temukan di Instagram аку Загрузить Di sini Karna Bertujuan Memperingati Bulan Suci …

Dj Sahur Sahur Terbaru 2021 Mantull Full Bass Versus Bahasa Jepang Скачать бесплатно Mp3 Mp4 … ДИ ДЖАМИН ТИДАК НЕЙСАЛ ПУТАР САМПАИ АБИС ИЯ ТЕРИМА …

Привет, ребята, добро пожаловать обратно в канал, Альви Маулана Seperti biasa dalam video Kali ini kami semua sedangmbangunkan sahur keliling kerumah warga…

Саран пакай Хедшет !!!! °°° Хорошо, добро пожаловать обратно в мой Chanel Divideo seya kali ini saya cover lagu yang judulnya DJ SAHUR-SAHUR TERBARU 2021 COVER …

Lagu sahur yang terinspirasi dari Para Pemuda Manggis Pas. Semoga lagu ini berhasil menemani для Nofiners selama menjalani masa puasa. Селамат …

#gustafotovideo #tsanisahur #tsanipengendangcilik Sebelumnya mohon maaf, dikarenakan pandemi kita tidak bisa buat video menarik sesuai harapan…

Сенанг Биса Менг Хибур Калиан

Официальное видео от DJ SAHUR SAHUR ‘BANGUN SAHUR’ Подпишитесь на DJ Opus здесь: smarturl.it/subscribeDJOpus Lagu DJ Sahur Sahur Terbaru 2020 …

# djsahur2021 #Djtiktokviral #djsahursahur #arkhastory ВИРАЛ ТИКТОК !!! DJ SAHUR SAHUR MARI KITA BANGUN SAHUR | ТИКТОК ВИРАЛ 2021 Название: Сахур…

BANGUN DONG SAHUR..SAHUR .. !! TRUCK TAWAKAL # 3 BANGUNIN SAHUR PAKE SOUND SISTEM.Ets2

Слушайте песню Скачать

БАНГУН ДОНГ САХУР … САХУР … !! ГРУЗОВИК ТАВАКАЛ 3 БАНГУНИН САХУР ПАКЕТ ЗВУК СИСТЕМ. # TruckTawakal3BanguninSahur # EuroTruckSimulator2 …

Lagu dj sahur 2021 remix spesial ramadhan.. Cocok buat alarm saur saur ….. Dj saur saur ayo kita sahur full bass dan di remix menggunakan FL …

Юк Беланджа Мусульманская мода: shp.ee/zj3drkd Беланья пакаян ванита: shp.ee/8gey3ub Беланджа пакаян приа: shp.ee/wtm88ay Беланджа сепату ванита: …

DJ SAHUR SAHUR AYO KITA SAHUR TERBARU | РЕМИКС ПОЛНЫЙ БАС 2020 DJ SAHUR Пеньяни: йовита аурел Арасмсемен: К.C Самбер …

Video Animasi Bangunin Sahur Puasa Ramadhan, silahkan download Untuk membersangunkan kawan / saudara kalian Untuk menjalankan ibadah puasa …

Generasi penerus

—- ЛИРИК —— Саур Саур Саур Саур Саур Саур Мари Бангун Саур Саур Саур Саур Дулу Мумпунг Маси Ада Вакту Саур Саур Саур Дулу Мумпунг Белум Адзан…

Woww keren .. Para Pemuda Kreatif ini menciptakan lagu AYO KITA SAHUR | РАМАДАН АСЫК ..

Слушайте песню Скачать

Pemuda Kreatif menciptakan lagu AYO KITA SAHUR | КЕРЕН АБИС ДЖУДУЛ: АЙО КИТА САХУР Лирик: сахур сахур сахур сахур сахур сахур айо кита сахур ибу …

DJ Sahur 2020 Dukung Terus Channel ini agar Bisa Memberikan Informasi Hiburan, Tontonan Yang Ada di sekitar anda.Terimakasih atas kunjungannya …

Bocil pergi kerumah atta halilintar Untukmbangunkan sahur dibulan puasa ini. kericuhan terjadi baku hantam dengan satpamnya atta halilintar. юк …

Общественный ответ о загрузке Lagu Saur

Мам, ты делаешь мое сердце Саур! ДЛЯ ВСЕХ ВОЗРАСТОВ — суббота, 8 мая 2021 г.

Получите удовольствие от этого особенного мероприятия в нашем отеле St.Питерса! Узнайте, как смешивать цвета и создавать слои затенения, чтобы ваша картина выглядела великолепно, с пошаговыми инструкциями от живого инструктора. Мы будем играть музыку, пока будем рисовать и веселиться! Не пропустите, это будет очень весело!
Не требуется рисования или художественного опыта. Просто приходите и получайте удовольствие от непринужденной и веселой атмосферы, которую вы запомните.

СОБЫТИЕ ДЛЯ ВСЕХ ВОЗРАСТОВ (6+)
В этом классе приветствуются художники от 6 лет и старше! Дети должны быть в сопровождении взрослого.Только один взрослый на художника, если только взрослые тоже не рисуют. Поскольку это семейный урок, мы поощряем взрослых рисовать вместе со своими детьми! Из-за нехватки места не допускаются младшие братья и сестры, которые не рисуют.
Это класс безалкогольных напитков, поскольку он ориентирован на детей. Нет BYOB. Не стесняйтесь приносить с собой любые расфасованные безалкогольные напитки и закуски, которые захотите! (Мы рекомендуем закуски)

БРОНИРОВАНИЕ / VIP
Мы приглашаем к участию в этом мероприятии отдельных лиц, пары и группы! Просто убедитесь, что имя организатора вашей группы указано в поле для особых запросов при выезде, чтобы ваша группа разместилась вместе в нашей таблице рассадки.Если в вашей зарезервированной группе 10 или более человек, наши VIP-столы — это особая благодарность за то, что вы пригласили вашу группу на одно из наших ПУБЛИЧНЫХ мероприятий.

БРОНИРОВАНИЕ / ОТМЕНА
Все гости должны зарезервировать места за 24 часа до мероприятия. Мы рекомендуем не откладывать дела на потом, чтобы гарантировать себе место. Оплата требуется во время бронирования, и мы НЕ предлагаем возврат средств, но кредит магазина будет предложен тем, кто отменяет бронирование не менее чем за 48 часов.

** Ознакомьтесь с нашей Политикой в отношении COVID-19 в нашем блоге.

** Painting with a Twist оставляет за собой право отменить занятия в случае непредвиденных обстоятельств. Регистранты будут уведомлены не менее чем за 24 часа до начала занятий, и будет произведен возврат средств.

Подмножество фосфатаз PP2C.D, локализованных в плазматической мембране, негативно регулируют SAUR-опосредованную экспансию клеток у Arabidopsis

Цитата: Ren H, Park MY, Spartz AK, Wong JH, Gray WM (2018) Подмножество плазматических мембран — локализованный PP2C.D-фосфатазы негативно регулируют SAUR-опосредованную экспансию клеток Arabidopsis. PLoS Genet 14 (6): e1007455. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1007455

Редактор: Глория К. Мудай, Университет Уэйк Форест, США

Поступила: 9 января 2018 г .; Дата принятия: 30 мая 2018 г .; Опубликован: 13 июня 2018 г.

Авторские права: © 2018 Ren et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (https://www.nih.gov, GM067203 для WMG) и Национальным научным фондом (https://www.nsf.gov, MCB-1613809). в WMG). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Растительный гормон ауксин регулирует почти все аспекты роста и развития, включая эмбриогенез [1], развитие корней [2], гравитропизм [3], развитие листьев [4], развитие сосудов [5], фототропизм [6] ], избегание тени [6], развитие апикальной меристемы побега [7], формирование цветочного зачатка [5], развитие тычинок [8] и развитие гинецея [9]. На клеточном уровне ауксин регулирует эти процессы посредством контроля клеточного деления, размножения и дифференцировки [10, 11].Ауксин воспринимается корецепторным комплексом, который состоит из репрессоров транскрипции AUXIN / INDOLE-3-ACETIC ACID 1 / AUXIN SIGNALING F-BOX PROTEINSE 1 / AUXIN SIGNALING F-BOX и AUXIN / INDOLE-3-ACETIC ACID (AUX / IAA) в ядре. Связывание ауксином комплекса TIR1 / AFB и AUX / IAA приводит к деградации белков AUX / IAA протеасомой 26S [12]. Затем деградация AUX / IAA снимает репрессию факторов транскрипции AUXIN RESPONSE FACTOR (ARF), чтобы активировать экспрессию ауксин-чувствительных генов [13].Эти ауксин-чувствительные гены, включая SMALL AUXIN UP RNAs ( SAURs ) [14], затем регулируют опосредованные ауксином клеточные, физиологические процессы и процессы развития.

Основная функция ауксина в росте и развитии растений — регулирование размножения клеток. Было высказано предположение, что индуцированная ауксином клеточная экспансия происходит посредством кислотного механизма роста, который был впервые предложен в 1970-х годах [15, 16]. Согласно этой теории, ауксин активирует H ⁺ -АТФазы плазматической мембраны (PM) (известные как AHA / ARABIDOPSIS H + -ATPases у Arabidopsis), которые перекачивают протоны через плазматическую мембрану, тем самым подкисляя апопласт и повышая мембранный потенциал.Более кислый апопластный pH активирует экспансины и другие ферменты ремоделирования клеточной стенки, что приводит к увеличению растяжимости клеточной стенки. Кроме того, гиперполяризация плазматической мембраны способствует увеличению поглощения растворенных веществ и воды, обеспечивая повышенный тургор для ускорения роста клеток. В последние годы несколько исследований предоставили молекулярную поддержку опосредованной ауксином активации PM H ⁺ -АТФазы во время роста гипокотилей у Arabidopsis. Ауксин индуцирует фосфорилирование предпоследнего треонина (Thr ⁹⁴⁷ в AHA2), ключевого регуляторного сайта PM H ⁺ -АТФаз, без изменения содержания белка AHA [17].Это увеличение фосфорилирования AHA Thr ⁹⁴⁷, вероятно, является результатом индуцированной ауксином экспрессии SAUR , поскольку сверхэкспрессия GFP-SAUR19 способствует фосфорилированию AHA-Thr ⁹⁴⁷, удлинению гипокотилей и растяжимости клеточной стенки [18, 19] . Более того, в соответствии с гипотезой о том, что кислотный рост требует ауксин-опосредованной экспрессии генов, недавно было показано, что канонический ядерный сигнальный путь TIR1 / AFB-AUX / IAA необходим для индуцированного ауксином удлинения гипокотиля и закисления клеточной стенки [20, 21].Вместе эти результаты предоставляют убедительные генетические и биохимические доказательства в поддержку теории кислотного роста.

Белки

SAUR способствуют активации PM H ⁺ -АТФазы и, как следствие, размножению клеток, ингибируя активность протеинфосфатаз типа 2C, принадлежащих к подсемейству D (PP2C.D) [18, 19]. PP2C представляют собой Mg ²⁺ / Mn ²⁺-зависимые ферменты, которые эволюционно консервативны от прокариот до эукариот [22, 23]. Геном Arabidopsis кодирует восемьдесят PP2C, девять из которых относятся к D-субкладу [22].Недавние исследования показали участие членов семейства PP2C.D в регуляции развития апикальных крючков [18, 24], индуцированного ауксином размножения клеток [18], старения листьев [25] и иммунного ответа [26]. В нашей предыдущей работе [18] мы обнаружили, что растения, несущие искусственную микроРНК (амиРНК), нацеленную на пять членов семейства D-клады, обладали фенотипами, аналогичными, хотя и намного более слабыми, чем у линий сверхэкспрессии GFP-SAUR19 , включая увеличенную длину гипокотиля, гиперчувствительность. до LiCl и повышенное подкисление среды.Хотя это открытие предоставило первоначальную генетическую поддержку антагонистической роли белков SAUR и PP2C.D в регуляции активности PM H ⁺ -АТФазы и размножения клеток, идентичность и функциональные отношения конкретных вовлеченных членов семейства PP2C.D оставались неопределенными. Более того, обратный генетический подход amiRNA не устраняет полностью функцию генов и может быть подвержен эффектам нецелевого действия. Здесь мы расширяем наши исследования функций этих фосфатаз, проводя генетическую характеристику pp2c . d Мутанты с потерей функции семейства . Мы обнаружили, что члены семейства PP2C.D демонстрируют различные паттерны субклеточной локализации, а локализованная на плазматической мембране субпопуляция, фосфатазы PP2C.D2, D5 и D6, играют важную роль в противодействии SAUR-опосредованной регуляции PM H ⁺ — Активность АТФазы, рост клеток, рост и развитие растений.

Результаты

ПП2С . D гены экспрессируются широко

Для исследования роли PP2C .Гены семейства D в росте и развитии растений, мы исследовали PP2C . Экспрессия гена D с использованием репортерного гена GUS (β-глюкуронидаза), управляемого природным PP2C . D промоторы. Мы создали трансгенные растения Arabidopsis, экспрессирующие PP2C . D1pro : EGFP-GUS транскрипция или PP2C . D (2–9) pro : PP2C . Конструкции трансляционного репортера D (2–9) -GUS .Все PP2C . D гены, кроме PP2C . D7 были экспрессированы в семядолях и гипокотилях выращенных на свету проростков (фиг. 1A). В корнях световых проростков все PP2C . D гены, кроме PP2C . D1 и PP2C . D7 экспрессировались повсеместно (рис. 1В). ПП2С . D1 слабо экспрессируется специфически в зоне растяжения корня, а PP2C . D7 слабо экспрессируется по всему корню, за исключением области кончика корня (рис. 1B). Все PP2C . Гены D также экспрессировались в семядолях и гипокотилях этиолированных проростков, за исключением PP2C . D7 , который экспрессировался только в гипокотилях (рис. 1С). Интересно, что PP2C . D1 обнаруживает более сильную экспрессию на внутренней стороне апикального крючка (рис. 1C и 1D), что согласуется с предыдущими открытиями, касающимися PP2C . D1 в виде апикального крючка [18, 24]. Все PP2C . D гены, кроме PP2C . D7, экспрессировались в черешках и розеточных листьях двухнедельных растений, а PP2C . D7 очень слабо экспрессировался на черешках (S1A фиг.). В цветах и стручках все PP2C . D гены, кроме PP2C . D7, экспрессировались во множестве органов и стручков цветка, а PP2C . D7 слабо экспрессируется в лепестках (S1B и S1C фиг.). В частности, PP2C . D1 , D2 , D5 и D6 сильно экспрессировались в филаментах тычинок. ПП2С . Экспрессия D8 была высоко обогащена в пестиках, а PP2C . D4 и D6 показали сильную экспрессию в пыльниках. Отсутствие или низкий уровень PP2C . D7 Экспрессия почти во всех исследованных органах согласуется с результатами многочисленных транскриптомных исследований, собранных в базе данных браузера Arabidopsis eFP (S2 Рис) [27].

Рис. 1. Образцы экспрессии PP2C . D-GUS репортеров.

( A) Всходы пятидневных светлых проростков. (B) Корни 5-дневных проростков, выращенных на свету. (C) Побеги 3-дневных этиолированных сеянцев. (D) Апикальный крючок двухдневного этиолированного сеянца. Окрашивание GUS проводили при 37 ^o ° C в течение 24 (A-C) или 4 часов (D). Масштабные линейки = 1 мм (A-C) или 0,5 мм (D).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1007455.g001

В совокупности наши данные по экспрессии GUS демонстрируют, что все PP2C . D гены, кроме PP2C . D7 широко экспрессируются в большинстве органов и тканей в течение жизненного цикла растений, особенно в растущих органах и тканях, включая гипокотили, молодые корни и листья, а также волокна тычинок. Эти результаты показывают, что модель PP2C . Гены семейства D могут играть важную роль в различных процессах роста и развития растений.

Белки PP2C.D демонстрируют четкую субклеточную локализацию

Субклеточная локализация PP2C.Фосфатазы семейства D ранее были исследованы с использованием зеленого флуоресцентного белка (GFP) в качестве репортера в трансгенных растениях Arabidopsis, несущих репортерные конструкции, управляемые промотором вируса мозаики цветной капусты (CaMV) 35S [28]. Однако, поскольку сверхэкспрессия, управляемая промотором 35S , может вызывать неправильную локализацию флуоресцентного слитого белка, мы дополнительно исследовали субклеточную локализацию фосфатаз семейства PP2C.D с использованием нативного PP2C . Промоторы D для экспрессии PP2C.Слитые белки D-GFP. Мы сгенерировали PP2C . D (1–9) pro : PP2C . D (1–9) -GFP Трансгенные растения Arabidopsis. Поскольку наш репортерный анализ GUS показал, что все члены семейства PP2C.D, кроме PP2C . D1 и D7 были сильно экспрессированы в кончиках корней (рис. 1В), мы первоначально исследовали локализацию PP2C.D-GFP в клетках корневой меристемы и зоны элонгации.

Предыдущие исследования показали, что PP2C.D1, также известный как APD7 (Arabidopsis PP2C clade D 7) [28] или SSPP (SENESCENCE-SUPPRESSED PROTEIN PHOSPHATASE) [25], находится в ядре и цитоплазме клеток корня [28] или только в цитоплазме протопластов мезофилла [25].В соответствии с нашим PP2C . D1pro : Результаты репортера EGFP-GUS , флуоресценция PP2C.D1-GFP в кончиках корней была ниже нашего предела обнаружения. Однако, начиная с PP2C . D1 индуцируется ауксином [29], когда PP2C . D1pro : PP2C . проростки D1-GFP обрабатывали ИУК, наблюдалась устойчивая экспрессия с флуоресценцией GFP, очевидной как в ядрах, так и в цитозоле (рис. 2А). Чтобы лучше изучить локализацию PP2C.D1 без осложнений со стороны экзогенной ИУК, мы исследовали апикальные крючки этиолированных проростков.В соответствии с паттерном экспрессии GUS (фиг. 1C и 1D), флуоресценция GFP специфически наблюдалась в эпидермальном слое внутренней стороны крючка (фиг. 2B). Подобно корням, обработанным ауксином, PP2C.D1, по-видимому, локализуется как в ядрах, так и в цитоплазме.

Рис. 2. Дифференциальная локализация слитых белков PP2C.D-GFP.

(A) Локализация слитых белков PP2C.D-GFP в кончиках корней 5-дневных проростков. ПП2С . D1-GFP проростки обрабатывали 10 мкМ IAA в течение 4 часов для увеличения экспрессии до детектируемых уровней.(B) Локализация слитого белка PP2C.D1-GFP в апикальных крючках 2-дневных этиолированных проростков, окрашенных 10 мкг / мл йодида пропидия (PI) в течение 30 мин. (C) Локализация слитого белка PP2C.D8-GFP в кончиках корней 5-дневных проростков. Проростки контрастно окрашивали 0,5 мкМ MitoTracker Red CMXRos (Invitrogen) в течение 20 мин. (A – C) Кончики корней и апикальные крючки наблюдались под спектральным конфокальным микроскопом Nikon A1. Масштабные линейки = 50 мкм (A), 25 мкм (B) или 10 мкм (C).

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pgen.1007455.g002

В соответствии с предыдущими выводами с использованием 35S -управляемых репортеров GFP [28], PP2C.D2 / APD2, PP2C.D5 / APD6 и PP2C.D6 / APD3, локализованных исключительно для периферия клеток корневых клеток, в соответствии с локализацией плазматической мембраны (рис. 2А). Недавно сообщалось, что PP2C.D3 / PP2C38 находится на плазматической мембране и во внутриклеточных точках эпидермальных клеток листьев Arabidopsis, сверхэкспрессирующих PP2C . D3-GFP , управляемый промотором 35S [26].В отличие от этих результатов, хотя мы действительно обнаружили некоторый сигнал PP2C.D3-GFP вблизи периферии клетки, значительная флуоресценция также наблюдалась во внутриклеточных точках и ядрах (рис. 2А). Сходным образом PP2C.D4 / APD4 обнаруживает как ядерную, так и цитозольную локализацию (Рис. 2A). PP2C.D7 / APD9 ассоциируется с плазматической мембраной и эндомембранами [28]. Хотя мы исследовали много независимых PP2C . D7pro : PP2C . D7-GFP строк, нам не удалось обнаружить PP2C.Экспрессия белка D7-GFP в любых исследованных органах, что согласуется с низкой экспрессией, наблюдаемой с репортером GUS (фиг. 1B) и транскриптомными исследованиями (S2 фиг.). Сигналы PP2C.D8-GFP и MitoTracker совместно локализуются в клетках корня (Рис. 2C), подтверждая предыдущие открытия, что PP2C.D8 / APD5 локализуется в митохондриях [28]. Наконец, Tovar-Mendez et al. (2014) сообщили, что PP2C.D9 / APD8 локализуется в цитоплазме, но не в ядре [28]. Наши результаты подтверждают этот вывод, хотя и похожи на PP2C.D3, цитозольная флуоресценция часто была точечной, а не равномерной (рис. 2А). Хотя мы не можем быть уверены, что все белки PP2C.D-GFP функциональны и локализуются точно так же, как эндогенный белок, ниже мы приводим доказательства того, что конструкции PP2C.D2-, D5- и D6-GFP кодируют функциональные белки (S5C Рис.). Учитывая высокую степень сходства последовательностей между членами семейства PP2C.D, кажется вероятным, что добавление C-терминального тега GFP не мешает функции PP2C.D. В совокупности наши результаты показывают, что файл PP2C.Фосфатазы семейства D обнаруживают отчетливую субклеточную локализацию, располагаясь в различных клеточных компартментах.

Субпопуляция белков PP2C.D, локализованная в плазматической мембране, ингибирует рост клеток

Гипокотиль Arabidopsis — отличная система для изучения удлиненного роста, поскольку его размер в основном контролируется размножением клеток [30]. Наши предыдущие исследования с использованием амиРНК для нокаута нескольких членов ( PP2C , D2 , D5 , D7 , D8 , D9 ) PP2C .Гены семейства D показали, что фосфатазы семейства PP2C.D могут функционировать избыточно, чтобы негативно регулировать рост гипокотилей [18]. Однако полученные в результате фенотипы роста были слабыми по сравнению с растениями со сверхэкспрессией GFP-SAUR19 . Чтобы окончательно определить вклад отдельных фосфатаз PP2C.D в рост клеток, мы проанализировали фенотип роста гипокотилей всех pp2c . d Мутанты со вставкой Т-ДНК (S3 фиг.). Полуколичественный анализ RT-PCR подтвердил, что pp2c .Мутанты со вставкой d1 , d2 , d5 , d6 , d7 , d8 и d9 , вероятно, были нулевыми аллелями (S4 Fig). Аналогично, pp2c . Ранее сообщалось, что инсерционные мутанты d3 и d4 являются нулевыми или мутантами с тяжелым нокдауном [26]. pp2c . d5 был единственным одиночным мутантом, который демонстрировал слегка увеличенный рост гипокотилей (S5A фиг.). Модель pp2c . d4 Мутант со вставкой Т-ДНК был недоступен, когда мы начали генерировать различные pp2c . d мутанты высшего порядка. Модель pp2c . d3 / 4 Двойной мутант был недавно опубликован [26], и мутантные проростки не проявляли явного фенотипа роста гипокотилей (S5B Рис.).

Отсутствие сильных одиночных мутантных фенотипов предполагает функциональную избыточность в пределах PP2C . D Семейство генов . Поэтому мы создали множество двойных, тройных и четверных мутантов (S5A Рис.). Учитывая локализацию в плазматической мембране SAUR19 и PM H ⁺ -АТФаз, нас особенно интересовали линии, в которых отсутствуют три члена семейства, локализованные в плазматической мембране, PP2C.D2, D5 и D6. Интересно, что мутации PP2C . D2 или PP2C . D6 усиливал фенотип роста гипокотилей pp2c . d5 (S5A рис.). Аналогично, pp2c . d2 pp2c . d6 Двойной мутант обладал фенотипом длинного гипокотиля. Однако длина гипокотиля не изменилась во всех других испытанных комбинациях двойных мутантов. Кроме того, файл pp2c . Тройные мутантные проростки d2 / 5/6 демонстрируют еще более сильный фенотип роста гипокотилей, демонстрируя гипокотили почти такой же длины, как и у проростков со сверхэкспрессией GFP-SAUR19 (рис. 3A, 3B и S5A).Подобно проросткам GFP-SAUR19 , это увеличение длины гипокотиля было результатом увеличения размножения клеток (рис. 3С). Напротив, различные комбинации тройных мутантов для pp2c . d1 , d3 , d8 и d9 не проявляли какого-либо явного фенотипа роста гипокотилей (S5A фиг.). Ранее мы обнаружили, что PP2C . D1 Сверхэкспрессия под контролем промотора 35S вызывала резкое уменьшение длины гипокотиля и роста растений [18].Однако анализ потери функции показывает, что эндогенный PP2C . D1 играет мало, если вообще играет роль в удлинении гипокотиля в наших условиях роста, как pp2c . d1 мутации не удалось усилить фенотип роста гипокотилей pp2c . d2 / 5/6 тройной мутант, а также комбинации мутантов более низкого порядка (S5A фиг.).

Рис. 3. Модель pp2c . d2 / 5/6 Тройной мутант демонстрирует повышенное размножение клеток и рост растений.

(A) Восьмидневные проросшие на свету саженцы. Масштабная линейка = 2 мм. (B) Длина гипокотиля 8-дневных проросших на свету проростков. Планки погрешностей = SD (n = 47). (C) Длина эпидермальных клеток 8-дневных световых гипокотилей проростков. Были измерены апикальные 10 клеток из 10 проростков. Планки погрешностей = SD. (D) Анализы ингибирования корня LiCl. Пятидневные проросшие на свету проростки, выращенные на чашках с ATS, переносили на чашки с ATS или ATS + 10 мМ LiCl на 3 дня. После переноса измеряли рост новых корней. Планки погрешностей = SD (n = 25–38).(E) Анализы подкисления среды. Шестидневные выращенные на свету проростки, выращенные на чашках ATS, переносили на чашки, содержащие индикатор pH бромкрезоловый пурпурный (BCP, pH 6,5), и изменение цвета среды наблюдали через 6 дней. ( F) Уровни Thr ⁹⁴⁷ -фосфорилированных белков AHA по данным связывания GST-14-3-3. Загружали пять микрограммов микросомальных фракций, приготовленных из 6-дневных проростков, выращенных на свету. Связанные с AHA и GST-14-3-3 белки AHA детектировались анти-AHA и анти-GST антителами, соответственно.(G) Побеги трехнедельных растений. Масштабная линейка = 1 см. (H) Участки розеточных листьев трехнедельных растений. Общую площадь листьев растений измеряли с помощью Photoshop. Планки погрешностей = SEM (n = 23–28). (I) Цветы. Масштабные линейки = 0,5 мм. (J) Апикальные крючки трехдневных этиолированных проростков. Масштабная линейка = 0,5 мм. (K) Апикальные углы крючков трехдневных этиолированных проростков. Планки погрешностей = SD (n = 29–35). (L) Уменьшение фототропного роста pp2c . d2 / 5/6 саженцы. Четырехдневные этиолированные проростки фотостимулировали односторонним синим светом в течение 2, 4, 6 и 8 часов и измеряли углы изгиба гипокотилей с помощью ImageJ.Планки погрешностей = SEM (n = 14–16). (B, C, H и K) Различные буквы над полосами указывают на значительные различия (P <0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1007455.g003

Чтобы подтвердить, что pp2c . Фенотип длинного гипокотиля d2 / 5/6 был фактически обусловлен потерей трех фосфатаз, локализованных в PM, мы трансформировали тройной мутант с помощью PP2C . D (2 , 5 , 6) pro : PP2C .Репортерные конструкции D (2 , 5, , 6) -GFP , используемые для оценки локализации (рис. 2). Все три слитые конструкции GFP восстанавливали длину гипокотиля по крайней мере до соответствующего двойного мутанта (S5C фиг.). В линиях D2- и D5-GFP наблюдалась избыточная комплементация, при этом длины гипокотилей возвращали длину дикого типа. Предположительно, это связано с позиционными эффектами, которые могут привести к скромному PP2C . D сверхэкспрессия. Вместе вышеуказанные генетические находки указывают на то, что PP2C локализуется в плазматической мембране.Белки D2, D5 и D6 являются основными фосфатазами PP2C.D, которые негативно регулируют рост клеток во время роста гипокотилей.

Начиная с версии pp2c . d2 / 5/6 Тройной мутант обнаружил длинный гипокотильный фенотип, мы приступили к оценке этого мутанта на предмет других фенотипов, связанных со сверхэкспрессией GFP-SAUR19 . Как GFP-SAUR19 саженцы, pp2c . d2 / 5/6 проростки проявляли резкую гиперчувствительность к 10 мМ LiCl (фиг. 3D) и повышенное закисление среды (фиг. 3E), фенотипы, указывающие на повышенную активность PM H ⁺ -АТФазы [18, 31].Чтобы проверить эту возможность, мы исследовали статус фосфорилирования AHA-Thr ⁹⁴⁷ косвенно, используя метод дальнего вестерн-блоттинга GST-14-3-3. Несколько предыдущих исследований продемонстрировали, что этот анализ точно отражает статус фосфорилирования AHA-Thr ⁹⁴⁷ и соответствующие изменения в активности PM H ⁺ -АТФазы [17, 18, 32, 33]. Поразительное увеличение фосфорилирования AHA-Thr ⁹⁴⁷ наблюдалось как в GFP-SAUR19 , так и в pp2c . d2 / 5/6 саженцы (рис. 3F).Напротив, уровни фосфорилирования AHA-Thr ⁹⁴⁷ в pp2c . d1 / 3/8 Тройной мутант не заметно отличался от дикого типа (рис. 3F). Сильное генетическое взаимодействие, наблюдаемое в анализах роста гипокотилей, предполагает, что PP2C.D2, D5 и D6 действуют избыточным образом (S5A, рис.). В соответствии с этим понятием, в то время как pp2c . d2 / 5/6 Тройной мутант демонстрировал повышенные уровни фосфорилирования AHA-Thr ⁹⁴⁷, фосфорилирование у одиночных мутантов было сравнимо с фосфорилированием дикого типа (фиг. 3F).Вместе наши генетические и биохимические данные демонстрируют, что эти локализованные в PM члены семейства PP2C.D функционируют избыточно, чтобы регулировать активность PM H ⁺ -АТФазы, чтобы контролировать рост клеток.

Хотя pp2c . d2 / 5/6 Растения не проявляли серьезных аномалий развития, несколько фенотипов роста были очевидны у более старых растений. Трехнедельный pp2c . d2 / 5/6 Растения имели немного более крупные розеточные листья, чем у растений дикого типа, но, как и в случае роста гипокотилей, этот фенотип был немного более драматичным у растений GFP-SAUR19 (фиг. 3G и 3H).В цветах, pp2c . d2 / 5/6 Цветки имели более длинные тычинки и пестики, чем у цветков дикого типа (рис. 3I). В то время как цветы GFP-SAUR19 не обнаруживают фенотипов длинных тычинок и пестиков (Рис. 3I), сообщалось об увеличении длины тычинок для растений, экспрессирующих слитые белки SAUR63-GFP или GUS [34]. Высота и длина стебля зрелых растений pp2c . d2 / 5/6 Растения также были немного крупнее растений дикого типа (S5D и S5E фиг.).В то время как растения GFP-SAUR19 не проявляли очевидного фенотипа роста кремнезема (S5E Fig), недавно сообщалось об усиленном росте кремния у трансгенных растений Arabidopsis, сверхэкспрессирующих SAUR8 , SAUR10 и SAUR16 [35].

ПП2С . D1 по-разному экспрессируется в апикальном крючке этиолированных проростков (фиг. 1D и 2B) и этиолированных pp2c . Мутанты d1 , а также проростки GFP-SAUR19 обнаруживают дефектное развитие апикальных крючков [18, 24].В то время как pp2c . Одинарные мутанты d2 , d5 и d6 развивают апикальные крючки, сопоставимые с диким типом [18], учитывая функциональную избыточность, которую мы наблюдали в других анализах этих членов семейства, мы исследовали фенотип апикального крючка у pp2c. . d2 / 5/6 тройной мутант. Действительно, как и этиолированные проростки GFP-SAUR19 , pp2c . У проростков d2 / 5/6 были обнаружены частично открытые апикальные крючки и расширенные семядоли (рис. 3J и 3K).В нашей предыдущей работе [36] было показано, что проростки GFP-SAUR19 демонстрируют пониженный фототропизм, что свидетельствует об участии белков SAUR в ответах тропического роста. В соответствии с этим представлением, было обнаружено, что транскрипты SAUR преимущественно накапливаются на удлиненной стороне изгибающихся органов [37–39]. Поэтому мы исследовали, могут ли PP2C.D2, D5 и D6 действовать в фототропном ответе. При воздействии одностороннего синего света этиолированный pp2c . d2 / 5/6 проростки демонстрировали резко сниженную фототропную кривизну (рис. 3L), что позволяет предположить, что SAUR-опосредованное ингибирование PP2C.Активность D2 / 5/6 на светлой дистальной стороне гипокотиля может лежать в основе фототропного изгиба. На основании фенотипов повышенного роста pp2c . d2 / 5/6 растений и их сильное фенотипическое сходство с SAUR растениями с повышенной функциональностью, а также сходные эффекты на фосфорилирование PM H ⁺ -АТФазы Thr ⁹⁴⁷, наши результаты предполагают, что PP2C.D2 , Фосфатазы D5 и D6 являются первичными эффекторами белков SAUR, локализованных на плазматической мембране, которые регулируют рост растений.

Фосфатазы PP2C.D взаимодействуют с SAUR19 и PM H

⁺ -ATPases

Вышеупомянутые генетические исследования показали, что PP2C.D2, D5 и D6 являются основными фосфатазами D-клады, которые негативно регулируют SAUR-опосредованное размножение клеток. Наша предыдущая работа выделила PP2C.D1, D5 и D6 как белки, взаимодействующие с SAUR19, в скрининге дрожжевой двугибридной библиотеки [18]. Мы подтвердили, что PP2C.D2 также взаимодействует с SAUR19 в этой системе (рис. 4A). Мы также протестировали остальных членов семейства PP2C.D и обнаружили, что PP2C.D3, D4 и D8 также могут взаимодействовать с SAUR19 (S6A фиг.). Положительные взаимодействия не были обнаружены для PP2C.D7 или PP2C.D9 (S6A фиг.), Однако PP2C.D7, по-видимому, не экспрессировался в дрожжах, а экспрессия PP2C.D9 была довольно низкой по сравнению с PP2C.D1 (S6B фиг.).

Рис. 4. Фосфатазы PP2C.D взаимодействуют с SAUR19 и H ⁺ -АТФаз плазматической мембраны.

( A) Дрожжевой двугибридный анализ, демонстрирующий взаимодействие белков PP2C.D2 и SAUR19. Клетки высевали на подходящую среду для селекции и выращивали при комнатной температуре от 3 до 6 дней.(B) Анализ Co-IP, выявляющий взаимодействие белков PP2C.D5-HA и GFP-SAUR19. Микросомальные белки получали из этиолированных проростков 6-дневного возраста. Для анализов совместного IP использовали преиммунную сыворотку крови (пре) или антитела против GFP. PP2C.D5-HA и GFP-SAUR19 детектировались антителами против HA и против GFP соответственно. (C) Анализ Co-IP, выявляющий взаимодействия белка PP2C.D и PM H ⁺ -АТФазы. Микросомальные белки получали из 8-дневных проростков, выращенных на свету. Для анализов совместного IP использовали преиммунную сыворотку крови (пре) или антитела против AHA.Белки PP2C.D2-GFP, PP2C.D5-GFP, PP2C.D8-GFP и PP2C.D6-HA детектировались антителами против GFP и против HA соответственно. (D) Экспрессия PP2C.D устраняет комплементацию AHA2 активности PM H ⁺ -АТФазы в дрожжах. Гал, галактоза; Глюкоза, глюкоза; Vec, пустой вектор. (E). In vitro Анализы дефосфорилирования AHA2, исследующие дефосфорилирование AHA2-Thr ^947P, экспрессированного в дрожжах. (B и C) 300–400 мкг и 10–20 мкг микросомальных белков использовали для ко-IP и вестерн-блоттинга соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1007455.g004

Чтобы изучить взаимодействия белков в planta , мы создали трансгенные растения Arabidopsis, коэкспрессирующие PP2C.D2-HA, D5-HA или D6-HA. под управлением родной PP2C . Промоторы D и GFP-SAUR19, управляемые промотором 35S , и исследовали их взаимодействия путем коиммунопреципитации (co-IP) с использованием солюбилизированных микросомных фракций. Коиммунопреципитировались PP2C.D5-HA и GFP-SAUR19, что подтверждает их взаимодействие в Arabidopsis (фиг. 4B).Однако нам не удалось успешно коиммунопреципитировать GFP-SAUR19 с PP2C.D2-HA и PP2C.D6-HA. Хотя это может быть связано с техническими ограничениями этого анализа, мы не можем исключить возможность того, что SAUR19 не взаимодействует с этими фосфатазами in planta . Скорее, учитывая большое количество белков SAUR, кажется вполне возможным, что PP2C.D2 и D6 могут предпочтительно взаимодействовать с др. Белками SAUR, ассоциированными с плазматической мембраной.

Выраженное увеличение фосфорилирования AHA-Thr ⁹⁴⁷ наблюдается в pp2c .Тройной мутант d2 / 5/6 (рис. 3F) идентифицировал этот фосфозит как предполагаемый субстрат фосфатаз PP2C.D2, D5 и D6. Поэтому мы исследовали потенциальные взаимодействия между этими белками и PM H ⁺ -АТФаз с помощью тестов co-IP и бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC). PP2C.D2-GFP, D5-GFP и D6-HA коиммунопреципитируются с белками AHA (рис. 4C). Напротив, не наблюдалось заметного взаимодействия между AHA и PP2C.D8-GFP (рис. 4C), что позволяет предположить, по крайней мере, некоторую степень субстратной специфичности среди PP2C.D члены семьи. Кроме того, желтые флуоресцентные сигналы наблюдались на плазматической мембране эпидермальных клеток листа, когда AHA2-YFP ^N временно коэкспрессировался с PP2C. D2-YFP ^C, D5-YFP ^C и D6-YFP ^C в Nicotiana benthamiana листьев (S7 Рис). Эти результаты показывают, что фосфатазы PP2C.D2, D5 и D6 физически связываются с белками AHA in planta . Чтобы дополнительно проверить регуляторную природу этих взаимодействий, мы совместно экспрессировали фосфатазы PP2C с AHA2 в дрожжевом штамме RS-72 для анализов комплементации.В этом штамме клетки жизнеспособны только при выращивании на галактозной среде, поскольку ген эндогенной дрожжевой PM H ⁺ -АТФазы PMA1 управляется промотором GAL1 . Экспрессия AHA2 дополняет GAL1pro : PMA1 для восстановления роста на среде с глюкозой [33, 40]. Когда мы совместно экспрессировали PP2C.D2, D5 или D6 с AHA2, дрожжевые клетки RS-72 не могли расти на среде с глюкозой (рис. 4D), что указывает на то, что эти фосфатазы ингибируют функцию AHA2. Фактически, все члены семейства PP2C.D, за исключением PP2C.D8 были способны противодействовать функции AHA2 у дрожжей. Напротив, фосфатазы PP2C, не относящиеся к D-кладе Arabidopsis PP2C.I1 (At2g25070, PP2C I-клады) и PP2C.F9 (At1g43900, PP2C F-клады) [41], не смогли ингибировать функцию AHA2 в этой системе (рис. 4D), предполагая, что D-клады PP2C могут быть уникальными по своей способности ингибировать активность PM H ⁺ -АТФазы. Предположительно, PP2C.D1, D3, D4 и D9, все из которых обнаруживают некоторую степень цитозольной локализации у Arabidopsis, могут получать доступ к цитозольному C-концу AHA2 при сверхэкспрессии в дрожжах.Наши генетические (S5 рис.) И биохимические (рис. 3F) данные, однако, предполагают, что эти члены семейства не являются первичными регуляторами активности AHA in planta .

Мы ранее разработали in vitro анализ дефосфорилирования AHA2 с использованием плазматических мембран, полученных из дрожжевых клеток RS-72, экспрессирующих AHA2, для изучения SAUR-регуляции PP2C.D1-опосредованного дефосфорилирования AHA2-Thr ^947P [18]. Этот же анализ использовали для оценки способности фосфатаз PP2C.D2, D5 и D6 дефосфорилировать AHA2-Thr ^947P и ингибирования любой такой активности белками SAUR.Как ранее было показано для PP2C.D1 [18], рекомбинантные PP2C.D2 и PP2C.D5 катализируют дефосфорилирование AHA2-Thr ⁹⁴⁷, и эта активность сильно ингибируется добавлением очищенного белка SAUR9 (рис. 4E). Мы не смогли продемонстрировать фосфатазную активность рекомбинантного PP2C.D6 в этой системе или в анализах с использованием химического субстрата p -нитрофенилфосфат (pNPP), предполагая, что для этой фосфатазы могут потребоваться альтернативные условия реакции, кофакторы или посттрансляционные модификации. .Тем не менее, мы не можем исключить возможность того, что PP2C.D6 не является функциональной фосфатазой, а скорее может играть особую роль, такую как обеспечение функции каркаса для комплексов PP2C.D-субстрат. Однако, учитывая, что PP2C.D6 содержит высококонсервативный каталитический домен, вместе с нашими данными о взаимодействии и генетическими данными, демонстрирующими, что D6 действует избыточно с D2 и D5, кажется вероятным, что PP2C.D6 также дефосфорилирует AHA2-Thr ^947P и эту активность ингибируется белками SAUR.

ПП2С . Сверхэкспрессия D5 снижает рост клеток и рост растений

Для исследования эффектов PP2C . D увеличения функции на рост и развитие растений, мы попытались создать 35Spro : PP2C . D5-EYFP линий сверхэкспрессии. В то время как несколько первичных трансформантов Arabidopsis проявляли карликовый фенотип, мы не смогли получить никаких стабильных гомозиготных линий сверхэкспрессии, что позволяет предположить, что PP2C.Дозировка D5 может иметь решающее значение. Поэтому мы создали трансгенные растения Arabidopsis, экспрессирующие PP2C . D5-HA с приводом от PP2C . Промотор D5 в pp2c . d5 мутантный фон. Экспрессия белка PP2C.D5-HA спасала слегка увеличенный фенотип роста гипокотилей pp2c . d5 проростков (S8A фиг.), Демонстрируя, что PP2C.D5-HA является функциональным белком. Мы заметили, что некоторые трансгенные линии демонстрируют дефекты роста, включая снижение роста и фертильности.Серьезность дефектов роста зависела от уровней экспрессии белка PP2C.D5-HA. pp2c . d5 PP2C . D5-HA линии 6 и 7, которые не проявляли явных дефектов роста, экспрессировали более низкие уровни белка PP2C.D5-HA, в то время как линии 1 и 4, которые демонстрировали серьезные дефекты роста, экспрессировали более высокие уровни белка PP2C.D5-HA (S8B, рис. ). Поэтому мы выбрали pp2c . d5 PP2C . D5-HA линий 1 и 4 (в дальнейшем обозначаемых как D5-HA-OX для сверхэкспрессии) для дальнейшего фенотипического анализа для оценки эффектов PP2C . D5 Увеличение функции на рост и развитие растений.

по сравнению с диким типом и pp2c . d5 проростков, выращенных на свету D5-HA-OX проростков продемонстрировали снижение роста гипокотилей (фиг. 5A и 5B), более короткие эпидермальные клетки гипокотиля (фиг. 5C) и снижение роста корней (фиг. 5D). Этиолированные проростки D5-HA-OX также демонстрировали сильно сниженный рост гипокотилей (фиг. 5E и 5F). D5-HA-OX Растения демонстрировали более мелкие розеточные листья (фиг. 5G), замедленное старение листьев (фиг. 5H) и более мелкие цветы с более короткими тычинками (фиг. 5J).Вскоре после закрепления у растений D5-HA-OX наблюдались дефекты фертильности (рис. 5I). Однако ручное опыление пестиков D5-HA-OX пыльцевыми зернами D5-HA-OX привело к полному завязыванию семян (рис. 5K), что указывает на то, что дефекты фертильности вызваны уменьшенным удлинением тычинок, а не дефектной пыльцой. или оплодотворение. Любопытно, что при продолжающемся росте старые растения D5-HA-OX оправились от ранних дефектов мужской фертильности и смогли успешно завязать семена.Зрелые растения D5-HA-OX были меньше растений дикого типа и pp2c . d5 (рис. 5L) и имел более короткие силикаты (рис. 5M).

Рис. 5. PP2C . D5 Сверхэкспрессия снижает рост клеток и рост растений.

( A) Всходы семидневных проросших на свету сеянцев. Масштабная линейка = 2 мм. (B) Длина гипокотиля 7-дневных проросших на свету проростков. Планки погрешностей = SD (n = 33–43). (C) Длина эпидермальных клеток 8-дневных световых гипокотилей проростков.Были измерены апикальные 10 клеток из 10 проростков. Планки погрешностей = SD. (D) Длина первичного корня 7-дневных проросших на свету проростков. Планки погрешностей = SD (n = 37–51). (E) Побеги 7-дневных этиолированных сеянцев. Масштабная линейка = 5 мм. (F) Длина гипокотиля 7-дневных этиолированных проростков. Планки погрешностей = SD (n = 40–49). (G) 24-дневные растения. Масштабная линейка = 1 см. (H) 44-дневные растения. Первичные болты были удалены, чтобы лучше видеть листья розетки. Масштабная линейка = 1 см. (I) Побеги 44- или 51-дневных растений. Шкала шкалы = 4 см (вверху) или 1 см (внизу).(J) Цветы. Чашелистики и лепестки удаляли, чтобы лучше видеть волокна тычинок. Масштабная линейка = 1 мм. (K) Siliques. Пестики цветов D5-HA-OX линий 1 и 4 опыляли вручную их собственными пыльцевыми зернами. Масштабная линейка = 2 мм. (L) 73-дневные растения. Масштабная линейка = 4 см. (M) Siliques. Масштабная линейка = 4 мм. (N) Уровни Thr ⁹⁴⁷ -фосфорилированных белков AHA, отслеживаемые по связыванию GST-14-3-3. Загружали пять микрограммов микросомальных фракций, приготовленных из 6-дневных этиолированных проростков.Связанные с AHA и GST-14-3-3 белки AHA-Thr ^947P детектировались антителами против AHA и против GST, соответственно. (O) Анализ ингибирования корня LiCl. Шестидневные выращенные на свету проростки, выращенные на чашках с ATS, переносили на чашки с ATS или ATS + 10 мМ LiCl на 3 дня. После переноса измеряли рост новых корней. Планки погрешностей = SD (n = 49–73). (P) Анализы подкисления среды. Восьмидневные проросшие на свету проростки, выращенные на чашках ATS, переносили в чашки, содержащие индикатор pH бромкрезоловый пурпурный (BCP, pH 6.5), а среднее изменение цвета наблюдалось через 9 ( D5-HA-OX 1) или 12 ( D5-HA-OX 4) дней спустя. (B, C, D и F) Различные буквы над полосами указывают на значительные различия (P <0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1007455.g005

Чтобы оценить, соответствует ли PP2C . Сверхэкспрессия D5 вызывает снижение активности PM H ⁺ -АТФазы, мы исследовали статус фосфорилирования AHA-Thr ⁹⁴⁷ в проростках D5-HA-OX .Четкое снижение фосфорилирования AHA-Thr ⁹⁴⁷ наблюдалось в этиолированных проростках D5-HA-OX (фиг. 5N). В соответствии со снижением активности PM H ⁺ -АТФазы и последующим мембранным потенциалом, проростки D5-HA-OX проявили устойчивость к 10 мМ LiCl (фиг. 5O) и уменьшили подкисление среды (фиг. 5P). В совокупности наши результаты показывают, что PP2C . Сверхэкспрессия D5 вызывает уменьшение размножения клеток и роста растений, что, по крайней мере частично, вызвано сниженным фосфорилированием PM H ⁺ -АТФазы Thr ⁹⁴⁷ и соответствующим снижением активности фермента.

Сверхэкспрессия GFP-SAUR19 подавляет дефекты роста PP2C . D5 Растения со сверхэкспрессией

Геном Arabidopsis содержит 79 генов SAUR . Из-за обширной функциональной избыточности сложно изучить функции белков SAUR в росте и развитии растений с использованием подхода потери функции [14]. Наши предыдущие биохимические исследования показали, что белки SAUR ингибируют активность фосфатазы PP2C.D (рис. 4E) [18].Чтобы проверить эту гипотезу генетически, мы создали растения арабидопсиса, коэкспрессирующие белки GFP-SAUR19 и PP2C.D5-HA, путем скрещивания трансгена 35Spro : GFP-SAUR19 с линией 1 D5-HA-OX и исследовали эффекты сверхэкспрессии GFP-SAUR19 на дефекты роста PP2C . Растения со сверхэкспрессией D5-HA . Вестерн-блоттинг подтвердил, что двойные трансгенные растения экспрессировали оба слитых белка на уровнях, сравнимых с уровнями, наблюдаемыми в родительских линиях (фиг. 6A).Поразительно, что сверхэкспрессия GFP-SAUR19 подавляла практически все аспекты фенотипов D5-HA-OX , включая дефекты роста гипокотиля, корня и розетки листьев (Рис. 6B-6E). Кроме того, мужская стерильность растений D5-HA-OX , вызванная дефектным ростом удлинения тычинок, также подавлялась сверхэкспрессией GFP-SAUR19 (рис. 6F и 6G), как и дефекты D5-HA-OX в растении. высота и длина силикона (рис. 6H и 6I). Вместе эти результаты обеспечивают сильную генетическую поддержку гипотезы о том, что белки SAUR и PP2C локализованы на плазматической мембране.D-фосфатазы действуют антагонистически, регулируя рост растений.

Рис. 6. Сверхэкспрессия GFP-SAUR19 подавляет дефекты роста PP2C . D5 растения со сверхэкспрессией.

(A) Вестерн-блоттинг экспрессии белков GFP-SAUR19 и PP2C.D5-HA. Загружали двадцать микрограммов микросомальных белков из 8-дневных растений, выращенных на свету. GFP-SAUR19, PP2C.D5-HA и контроль загрузки SEC12 детектировались антителами против GFP, против HA и против SEC12 соответственно.(B) Длина гипокотиля 8-дневных проросших на свету проростков. Планки погрешностей = SD (n = 33–53). (C) Длина первичного корня 8-дневных проростков, выращенных на свету. Планки погрешностей = SD (n = 41–51). (D) Длина гипокотиля 7-дневных этиолированных проростков. Планки погрешностей = SD (n = 68–78). (E) 30-дневные растения. Первичные болты были удалены, чтобы лучше видеть листья розетки. Масштабная линейка = 1 см. (F) Вершина 53-дневных растений. Масштабная линейка = 1 см. (G) Цветы. Масштабная линейка = 2 мм. Чашелистики и лепестки удаляли, чтобы лучше видеть волокна тычинок.(H) 66-дневные растения. Масштабная линейка = 4 см. (I) Siliques. Масштабная линейка = 2 мм. (B-D) Различные буквы над полосами указывают на значительные различия (P <0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1007455.g006

Ауксин индуцирует экспрессию подмножества

PP2C . Гены D и высокая температура повышают уровень белка PP2C.D2

Предыдущие транскриптомные анализы гипокотилей ауксин-чувствительных генов показали, что PP2C . D1 и PP2C . D7 могут быть ауксин-индуцированными генами, поскольку их экспрессия была повышена при 120-минутной обработке синтетическим пиклорамом ауксина [42]. Кроме того, используя наш репортер PP2C.D1-GFP, мы продемонстрировали индуцируемую ауксином экспрессию PP2C . D1 в кончиках корней (рис. 2А). Изучить потенциальную ауксин-опосредованную регуляцию PP2C . Гены семейства D , мы исследовали PP2C . Экспрессия D-GUS у 5-дневных выращенных на свету PP2C . D1pro : EGFP-GUS и PP2C . D (2–9) pro : PP2C . D (2–9) -GUS проростки, обработанные 10 мкМ ИУК. В соответствии с предыдущими данными [42], ауксин индуцировал PP2C . Экспрессия D7-GUS в гипокотилях (фиг. 7A). В наших условиях индукция ауксином PP2C . D1pro : Экспрессия EGFP-GUS не была очевидна в гипокотилях. Однако ауксин сильно индуцировал PP2C . D1pro : Экспрессия EGFP-GUS в зоне растяжения корня (фиг. 7B). Мы не наблюдали явной индуцированной ауксином экспрессии репортеров PP2C.D2-, D3-, D4-, D5-, D6-, D8- или D9-GUS.

Рис. 7. Ауксин индуцирует PP2C . D, экспрессия гена и высокая температура повышают уровень белка PP2C.D2.

(A) GUS-окрашенные побеги 5-дневных проросших на свету проростков, обработанных 10 мкМ ИУК в течение 4 часов. Шкала шкалы = 1 мм. (B) GUS-окрашенные корни 5-дневных проросших на свету проростков, обработанных 10 мкМ ИУК в течение 4 часов.Шкала шкалы = 1 мм. (C) qRT-PCR анализы SAUR и PP2C . D, экспрессия гена . РНК получали из 3-дневных проросших на свету проростков, обработанных 5 мкМ NAA или контрольным растворителем в течение различных периодов времени. Относительное выражение представляет собой значение выражения NAA / значение выражения mock. Результаты qRT-PCR были основаны на трех биологических повторностях. S19 , SAUR19 ; S23 , SAUR23 ; S9 , SAUR9 . Планки погрешностей = SD.(D) GUS-окрашенные побеги проросших на свету проростков. Двух- или четырехдневный PP2C . D2-GUS проростков, выращенных при температуре 20 ^o ° C, смещали до температуры 28 ^o ° C на 6 часов, 24 часа или 5 дней. Окрашивание GUS проводили при 37 ^o ° C в течение 2 часов (6 часов, 24 часов) или 1 часа (5 дней). (E) Вестерн-блоттинг экспрессии белка PP2C.D2-GFP. Двухдневный PP2C . D2-GFP проростков, выращенных при 20 ^o ° C, перемещали на 28 ^° ° C на 5 дней. 25 микрограммов общих белков из побегов загружали для вестерн-блоттинга с использованием антител против GFP и против SEC12.(F) QRT-PCR анализы SAUR и PP2C . D, экспрессия гена . РНК получали из выращенных на свету проростков, которые выращивали при 20 ^o ° C и сдвигали до 28 ^o ° C в течение разного времени. Относительная экспрессия представляет значение экспрессии 28 ^o C / значение экспрессии 20 ^o C. Результаты qRT-PCR были основаны на трех биологических повторностях. Планки погрешностей = SD. (G) Относительная длина гипокотиля 7-дневных проростков, выращенных на свету. Относительная длина гипокотиля представляет собой значение длины 28 ^o C / значение длины 20 ^o C.Планки погрешностей = SEM (n ≥ 22).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1007455.g007

Для более точного изучения кинетики индукции ауксином SAUR и PP2C . Экспрессия гена D , мы исследовали уровни транскриптов SAUR9 , 19 , 23 и PP2C . D1-9 гены в 3-дневных выращенных на свету проростках дикого типа, обработанных 5 мкМ NAA в течение 2 часов с помощью qRT-PCR. Ауксиновая индукция экспрессии гена SAUR наблюдалась в течение 10 минут, а пик индукции приходился на 20-30 минут (рис. 7C).В то время как ауксин также индуцировал PP2C . D1 и PP2C . Экспрессия гена D7 , кинетика была заметно задержана по сравнению с исследованными генами SAUR . ПП2С . D1 был слегка повышен через 30 минут, и экспрессия продолжала увеличиваться в течение 2 часов, тогда как PP2C . D7 Экспрессия не повышалась до 2 часов обработки ауксином (фиг. 7C). Эти результаты показывают, что по сравнению с генами SAUR , PP2C . D1 и PP2C . D7 демонстрируют отсроченный транскрипционный ответ на лечение ауксином.

Высокая температура индуцирует экспрессию генов семейства SAUR19 , что способствует росту гипокотилей [43]. Нам было любопытно, может ли высокая температура также повлиять на PP2C . D, экспрессия гена . ПП2С . D1pro : EGFP-GUS и PP2C . D (2–9) pro : PP2C . Саженцы D (2–9) -GUS были сдвинуты с 20 ^° ° C на 28 ^° ° C на 24 часа или 5 дней, а затем окрашены вместе с контрольными сеянцами, поддерживаемыми при 20 ^° ° C.Только PP2C . D2pro : PP2C . проростки D2-GUS показали повышенное окрашивание GUS в гипокотилях (фиг. 7D и S9). Поэтому мы провели временной курс, чтобы более тщательно изучить экспрессию PP2C.D2 в PP2C . D2pro : PP2C . D2-GUS проростков сместился с 20 ^o ° C на 28 ^° ° C. Хотя в ранние моменты времени (6 ч) не наблюдалось разницы, сильное окрашивание GUS в гипокотилях и черешках проростков сместилось до 28 ^°. C был замечен в более поздние моменты времени (рис. 7D).Чтобы получить дополнительные доказательства того, что высокая температура активирует уровни белка PP2C.D2, мы исследовали уровни белка PP2C.D2-GFP в PP2C . D2pro : PP2C . D2-GFP проростков сместились с 20 ^o ° C на 28 ^° ° C. Повышенные уровни белка PP2C.D2-GFP были обнаружены в побегах проростков, сдвинутых до 28 ^° ° C в течение 5 дней (рис. 7E). В совокупности эти результаты показывают, что высокая температура повышает уровень белка PP2C.D2.Поскольку оба репортера GUS и GFP являются трансляционными слияниями, это зависимое от температуры повышение может быть результатом транскрипционной или посттранскрипционной регуляции. Чтобы определить, является ли этот эффект результатом повышенной транскрипции, мы исследовали PP2C . Уровни транскрипта D2 в выращенных на свету проростках дикого типа смещались до 28 ^o ° C в течение 120 часов с помощью qRT-PCR. Как сообщалось ранее [43], высокая температура индуцировала экспрессию SAUR19 и SAUR22 в течение 3 часов, и уровни транскриптов оставались повышенными на протяжении всего времени (рис. 7F).Однако высокая температура не привела к повышению PP2C . D2 уровней транскрипта, предполагая, что наблюдаемое температурно-зависимое повышение уровней белка PP2C.D2-GUS и PP2C.D2-GFP должно происходить посттранскрипционно. Эти результаты предполагают, что в отличие от генов семейства SAUR19 , которые обнаруживают быстрый транскрипционный ответ на высокую температуру, PP2C.D2 обнаруживает замедленное посттранскрипционное увеличение содержания белка.

Антагонистическая регуляция роста клеток белками SAUR и PP2C.Фосфатаза D2 привела нас к предположению, что высокотемпературная активация изобилия белка PP2C.D2 может представлять собой дополнительный уровень контроля для предотвращения чрезмерного расширения клеток, вызванного повышенной экспрессией гена SAUR , что может вызвать чрезмерный рост растений. Чтобы проверить эту гипотезу, мы исследовали реакции роста гипокотилей pp2c . d2-1 и pp2c . d2-2 мутанты с потерей функции к высокой температуре. Двухдневные проростки дикого типа, выращенные при 20 ^o ° C, переносили на 28 ^o ° C на 5 дней и оценивали рост гипокотилей.Действительно, оба файла pp2c . d2 Мутантные линии показали усиленный ответ на высокую температуру по сравнению с контролями дикого типа (фиг. 7G). Напротив, pp2c . d5 и pp2c . d6 Одиночные мутанты демонстрировали зависящее от температуры увеличение длины гипокотиля, которое было сравнимо с диким типом. Кроме того, в то время как pp2c . d2 / 5/6 Тройной мутант также продемонстрировал повышенное удлинение при высокой температуре, это увеличение было не более серьезным, чем наблюдаемое с pp2c . d2 одиночных мутантов. Эти данные свидетельствуют о том, что высокая температура специфически активирует изобилие белка PP2C.D2, чтобы предотвратить чрезмерный рост гипокотилей.

Обсуждение

Размножение клеток — это фундаментальный клеточный процесс, необходимый для роста и развития растений. Наша предыдущая работа предположила, что локализованные на плазматической мембране белки SAUR ингибируют активность фосфатазы PP2C.D, чтобы активировать PM H ⁺ -ATPases, тем самым способствуя размножению клеток [18]. Используя систему гипокотилей Arabidopsis в качестве модели, мы демонстрируем, что PP2C локализуется исключительно на плазматической мембране.Фосфатазы D2, D5 и D6 отрицательно регулируют рост гипокотилей (рис. 2A и S5A). Эти белки физически связываются с PM H ⁺ -АТФазами и негативно контролируют рост клеток за счет дефосфорилирования предпоследнего остатка треонина PM H ⁺ -ATPases (рис. 4). Кроме того, мы демонстрируем, что все три фосфатазы могут взаимодействовать с SAUR19 в дрожжевых 2-гибридных анализах, что D5 коиммунопреципитирует с SAUR19 из растительных экстрактов и что ферментативная активность PP2C.D2 и D5 ингибируется связыванием SAUR.В то время как pp2c . d2 / 5/6 тройной мутант в значительной степени фенокопирует растения со сверхэкспрессией GFP-SAUR19 , примечательно, что гипокотили выращенных на свету pp2c . Саженцы d2 / 5/6 все еще были немного короче, чем саженцы GFP-SAUR19 (рис. 3A и 3B). Это указывает на то, что в дополнение к фосфатазам PP2C.D2, D5 и D6 дополнительные члены семейства PP2C.D могут вносить незначительный вклад в контроль длины гипокотиля. Согласуется с этой возможностью, все члены семейства, кроме PP2C . D7 сильно экспрессировались в гипокотилях (рис. 1A), и мы обнаружили, что все, кроме PP2C . D8 может противодействовать функции AHA2 в гетерологичной системе экспрессии дрожжей (фиг. 4D). Альтернативно, также возможно, что SAUR19 имеет регуляторные мишени в дополнение к фосфатазам PP2C.D, которые могут вносить вклад в SAUR19-опосредованную экспансию клеток. За исключением PP2C.D2, D5 и D6, оставшиеся члены семейства PP2C.D, по-видимому, не влияли на рост клеток при росте гипокотилей (S5A фиг.).Однако эти белки могут регулировать рост клеток, чтобы контролировать рост других конкретных органов или процессы развития. Подтверждая эту гипотезу, было обнаружено, что PP2C.D1 регулирует дифференциальный рост на апикальном крючке у этиолированных проростков [18, 24]. Наши результаты выясняют вклад отдельных фосфатаз PP2C.D в рост клеток и дают представление об ауксин-индуцированном росте клеток через механизм кислотного роста.

Предварительный компьютерный анализ белков PP2C.D идентифицировал предполагаемые сигналы двудольной ядерной локализации во всех 9 членах семейства и потенциальные трансмембранные области в PP2C.D1, D3, D4, D6, D7 и D9 [41]. Наш анализ PP2C . D (1–9) pro : PP2C . D (1–9) -GFP репортеры, а также предыдущее исследование с использованием 35Spro : PP2C . D-GFP репортеров [28] относительно плохо коррелируют с этими прогнозами. В то время как PP2C.D2, D5 и D6 локализованы исключительно на плазматической мембране, остальные члены семейства PP2C.D локализованы в различных клеточных компартментах, причем D8 демонстрирует митохондриальную локализацию, а D1, D3 и D4 демонстрируют как ядерную, так и цитозольную локализацию (рис. 2).В случае PP2C.D2, D5 и D6, два из которых лишены предсказанного трансмембранного размаха, неясно, как они ассоциируются с плазматической мембраной. Однако, поскольку все три физически взаимодействуют с PM H ⁺ -ATPases (Figs 4C and S7), привлекательная гипотеза состоит в том, что они рекрутируются на плазматическую мембрану через их взаимодействие с этими насосами H ⁺. Что касается членов семейства, не относящихся к плазматической мембране, интересно отметить, что некоторые белки SAUR, как было показано, также находятся в ядре (SAUR32 [44] и SAUR36 [45]) и цитозоле (SAUR32 [44], SAUR40 [ 46], SAUR41 [47], SAUR55 [45] и SAUR71 [46]).Однако функции белков SAUR в этих клеточных компартментах еще предстоит выяснить. Мы предполагаем, что эти белки SAUR могут регулировать локализованные сходным образом белки PP2C.D, чтобы контролировать статус фосфорилирования их соответствующих субстратов. Идентификация не локализованных в плазматической мембране регуляторных модулей SAUR-PP2C.D и их субстратов является захватывающей областью для будущих исследований.

Наши исследования потери и увеличения функции демонстрируют, что фосфатазы PP2C.D2, D5 и D6 действуют как негативные регуляторы и контролируют различные процессы роста растений, включая рост корней, гипокотилей, листьев, цветов и стручков.Эти белки играют решающую роль в росте удлинения, таком как рост гипокотилей и тычинок (рис. 3 и 5). Рост удлинения тычинок на поздних стадиях развития тычинок имеет решающее значение для достижения зрелой пыльцой рыльца для успешного опыления. Мутанты yuc1 / 2/6 , tir1 afb1 / 2/3 и arf6 arf8 обнаруживают короткие тычинки [48-50], указывая на важную функцию ауксина в росте удлинения тычинок. Было показано, что индуцированные ауксином гены семейства SAUR63 ( SAUR61-68 и SAUR75 ), вероятные нижестоящие мишени для факторов ауксинового ответа ARF6 и ARF8 [50], положительно регулируют рост удлинения тычинок [34], предполагая, что эти белки SAUR могут вносить вклад в опосредованный ауксином рост удлинения тычинок.Модель PP2C . Все гены D2 , D5 и D6 были высоко экспрессированы в тычинках (фиг. S1B) и pp2c . d2 / 5/6 и PP2C . D5 Цветки со сверхэкспрессией демонстрируют более длинные и более короткие тычинки, соответственно, чем у цветков дикого типа (фиг. 3I и 5J). Эти результаты убедительно показывают, что фосфатазы PP2C.D2, D5 и D6 негативно регулируют рост удлинения тычинок и, следовательно, могут быть важны для репродуктивного успеха растений.Было бы интересно определить, взаимодействуют ли эти три фосфатазы физически с белками семейства SAUR63, чтобы регулировать рост удлинения тычинок. Наш подробный фенотипический анализ pp2c . d2 / 5/6 и GFP-SAUR19 растений указывают, что pp2c . Растения d2 / 5/6 фенокопируют почти все известные фенотипы растений со сверхэкспрессией GFP-SAUR19 , включая повышенное размножение клеток, рост гипокотиля и листьев, дефектное развитие апикальных крючков и фототропный ответ, а также повышенное фосфорилирование PM H ⁺ -ATPase и активность (рис. 3).Эти находки предполагают, что фосфатазы PP2C.D2, D5 и D6 являются первичными эффекторами белков SAUR, локализованных в плазматической мембране, которые регулируют рост клеток.

Дифференциальный рост имеет решающее значение для развития растений и реакции роста на внешние раздражители, такие как свет и сила тяжести. Наши исследования предполагают, что PP2C.D2, D5 и D6 являются важными регуляторами дифференциального роста, т.к. тройной мутант обнаруживает дефекты как в фототропном изгибе, так и в развитии апикальных крючков. Ранее мы сообщали, что в то время как файл pp2c . d1 мутант обнаруживает дефекты развития апикального крючка, pp2c . Одинарные мутанты d2 , d5 и d6 демонстрировали апикальные крючки, сравнимые с контролем дикого типа [18]. Однако, в соответствии с нашей гипотезой, что эти фосфатазы функционируют избыточно, этиолированный pp2c . d2 / 5/6 проростки демонстрировали явные дефекты в формировании апикальных крючков (рис. 3J и 3K). Интересно, что в то время как PP2C . D1 специфически экспрессируется на внутренней стороне апикальных крючков (рис. 1C, 1D и 2B), PP2C .Выражение D2 , D5 и D6 кажется равномерным по всей длине крючка (рис. 1C). Вместе с наблюдаемыми различиями в субклеточной локализации (Рис. 2) эти находки подтверждают, что PP2C.D1 и три PM-локализованные фосфатазы, вероятно, играют разные роли в модулировании развития апикальных крючков. Кроме того, в отличие от PP2C . D1 , единообразная экспрессия членов семейства, локализованных в PM через апикальный крючок, предполагает, что регуляторные белки д. Экспрессироваться по-разному для достижения PP2C.Дифференциальный рост, опосредованный D2 / D5 / D6. Так как ауксин играет важную роль в развитии крючка, и известно, что ауксиновый ответ варьирует по апикальному крючку [51], кажется вероятным, что регулируемые ауксином белки SAUR выполняют эту функцию. Подтверждение этому утверждению можно найти в предшествующих исследованиях экспрессии генов в органах, стимулированных тропами, которые показали, что несколько генов SAUR по-разному экспрессируются в стеблях и гипокотилях, стимулированных тропами, причем экспрессия выше на удлиненной стороне органа [ 37–39, 52–55].Поскольку белки SAUR ингибируют активность PP2C.D, можно ожидать, что этот дифференциальный паттерн экспрессии SAUR приведет к дифференциальной активности PP2C.D (и, следовательно, PM H ⁺ -АТФазы) в органе, что приведет к тропическому изгибу. Действительно, недавно сообщалось о дифференциальном закислении апопласта у гипокотилей Arabidopsis, стимулированных гравистимуляцией [20]. В pp2c . d2 / 5/6 мутант , однако, первичные эффекторы функции SAUR отсутствуют, и, следовательно, возникают дефекты развития апикальных крючков и тропического изгиба.

В то время как гены SAUR быстро активируются в ответ на ауксин, мы не наблюдали опосредованную ауксином регуляцию большинства PP2C . D членов семейства в анализах репортера qRT-PCR или GUS (рис. 7C). ПП2С . D1 и PP2C . Однако D7 были заметными исключениями, поскольку оба гена были индуцируемыми ауксином, хотя и с замедленной кинетикой по сравнению с генами SAUR (рис. 7C). Хотя ни PP2C.D1 и PP2C. D7, по-видимому, играют важную роль в удлинении гипокотиля в стандартных условиях роста, возможно, что задержанная, индуцированная ауксином экспрессия потенциально может ослаблять SAUR-опосредованную регуляцию роста других органов или процессов, таких как развитие апикальных крючков. .

Более убедительные доказательства функционирования повышенной экспрессии PP2C.D для ослабления SAUR-опосредованного роста наблюдались в наших исследованиях индуцированного высокой температурой удлинения гипокотиля. У проростков арабидопсиса, выращенных в условиях высоких температур, наблюдаются удлиненные гипокотили [56, 57].Наши предыдущие исследования показали, что высокая температура индуцирует экспрессию генов семейства SAUR19 , что способствует росту гипокотилей [43]. В этом исследовании мы обнаружили, что высокая температура также специфически повышает уровень белка PP2C.D2 (рис. 7D, 7E и S9). Это увеличение, по-видимому, происходит после транскрипции, поскольку температура не влияет на PP2C . D2 уровней мРНК. По сравнению с высокотемпературной индукцией генов SAUR , увеличение содержания белка PP2C.D2 показало замедленный ответ на высокую температуру (рис. 7D и 7F).Мы демонстрируем, что это увеличение экспрессии PP2C.D2 является биологически значимым, поскольку два независимых pp2c . d2 Мутантные проростки продемонстрировали усиленный рост гипокотилей в условиях высоких температур (фиг. 7G). Эти результаты являются убедительным подтверждением гипотезы о том, что высокотемпературная активация содержания белка PP2C.D2 ослабляет рост гипокотилей, обеспечиваемый белками SAUR, предотвращая чрезмерный рост гипокотилей. Наши результаты предполагают новый уровень регуляции удлиненного роста, индуцированного высокой температурой.Определение основного механизма (ов), посредством которого температура влияет на изобилие белка PP2C.D2, такого как усиленная трансляция или повышенная стабильность белка, является захватывающей темой для будущих исследований, которые дополнительно прояснят наше понимание регуляции роста, индуцированного высокой температурой.

Материалы и методы

Растительный материал и условия роста

Идентификаторы локусов

Arabidopsis Genome Initiative для генов, использованных в этом исследовании, следующие: SAUR19, (At5g18010), SAUR9, (At4g36110), SAUR22 (At5g18050), SAUR23 (At5g18060), PP2C . D1 (At5g02760), PP2C . D2 (At3g17090), PP2C . D3 (At3g12620), PP2C . D4 (At3g55050), PP2C . D5 (At4g38520), PP2C . D6 (At3g51370), PP2C . D7 (At5g66080), PP2C . D8 (At4g33920), PP2C . D9 (At5g06750), PP2C . I1 (At2g25070), PP2C . F9 (At1g43900), AHA2 (4g31090) и AUX1 (At2g38120).

Arabidopsis thaliana Растения выращивали в условиях длинного дня (16 часов света / 8 часов темноты) при ~ 80 мкЭм ^-2 с ^-1 флуоресцентном освещении при 20–22 ^o ° C, если на рисунке не указано иное. легенды. Все трансгенные линии и мутанты относились к экотипу Columbia (Col). Поверхность семян стерилизовали в растворе, содержащем 30% отбеливателя и 0,04% тритона Х-100, и промывали стерильной водой. Семена обрабатывали холодом в течение 2-3 дней при температуре 4 ^o ° C для синхронизации прорастания.Проростки выращивали на чашках ATS, содержащих 1% сахарозы и 0,5% агаргеля (Sigma-Aldrich). Питательный раствор ATS содержал 5 мМ KNO ₃, 2,5 мМ KPO ₄, 2 мМ MgSO ₄, 2 мМ Ca (NO ₃) ₂, 50 мкМ Fe-EDTA, 70 мкМ H ₃ BO ₃, 14 мкМ MnCI ₂, 0,5 мкМ CuSO ₄, 1 мкМ ZnSO ₄, 0,2 мкМ Na ₂ MoO ₄, 10 мкМ NaCI и 0,01 мкМ CoCI _{2 _{2 _{297. Для анализа подкисления среды 6-8-дневные проростки, выращенные на свету, переносили из среды ATS в чашки, содержащие 0.04 мг / мл бромкрезола пурпурного (BCP, Sigma) и 0,5% агаргеля с pH, доведенным до 6,5 с помощью КОН, и инкубировали при освещении в течение длительного дня, как описано выше. После того, как изменения цвета среды стали видны, планшеты отображали на планшетном сканере.}}}

Статистический анализ

Все статистические анализы были выполнены с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) с помощью пакета программного обеспечения JMP Pro 13.1 (SAS Institute). Результаты теста HSD Тьюки (честно значимая разница) были сгруппированы по буквам, причем разные буквы указывали на значимые различия (P <0.05).

Анализ фототропизма

Стерилизованные семена обрабатывали холодом в течение 3 дней при 4 ° C в темноте, подвергали воздействию белого света в течение 2 часов при 20 ^o C для стимулирования прорастания семян, а затем инкубировали в течение 4 дней при 20 ^o C в темноте. . Этиолированные проростки фотостимулировали односторонним синим светом в течение различного времени, и измеряли углы изгиба гипокотиля с помощью ImageJ. Синий свет (470 нм) обеспечивался световой системой SNAP LITE (Quantum Devices).

Линии трансгенных растений

ПП2С . D1-D9 геномные ДНК, содержащие промоторы и кодирующие последовательности без стоп-кодонов, амплифицировали с помощью ПЦР (таблица S1) и клонировали в pENTR / D-TOPO с использованием набора для клонирования pENTR directional TOPO (Invitrogen). В большинстве случаев вся межгенная область между и PP2C . D стартовый кодон и предыдущий ген были включены. Длина вышележащей промоторной последовательности для каждого гена указана в таблице S1.Эти PP2C . Вставки D рекомбинировали в pGWB203 (GUS) [58], pGWB204 (GFP) [58] и pEarleyGate 301 (HA) [59] с использованием ферментной смеси Gateway LR clonase II (Invitrogen), чтобы получить PP2C . D (2–9) pro : PP2C . Д (2–9) -GUS , PP2C . D (1–9) pro : PP2C . D (1–9) -GFP и PP2C . D (2 , 5 , 6) pro : PP2C . D (2 , 5 , 6) -HA соответственно.Аналогично 4426 п.н. из PP2C . Последовательность промотора D1 была клонирована в pBGWFS7 (EGFP-GUS) [60] с получением PP2C . D1pro : EGFP-GUS конструкция. Все бинарные векторы вводили в штамм Agrobacterium tumefaciens GV3101 (вспомогательная плазмида pMP90) путем электропорации. Для трансформации Arabidopsis использовали метод окунания цветов [61]. Трансгенные растения отбирали на чашках ATS, содержащих 0,01% гербицида Баста (Bayer CropScience) или гигромицин (25 мкг / мл).

Анализы GUS

Окрашивание тканей растений GUS проводили при 37 ^o ° C в растворе, содержащем 100 мМ фосфата натрия (pH 7,0), 10 мМ ЭДТА, 0,5 мМ K ₄ Fe [CN] ₆, 0,5 мМ K ₃ Fe [CN] ₆, 0,1% тритона X-100 и 1 мМ X-Gluc (циклогексиламмониевая соль 5-бром-4-хлор-3-индоксил-бета-D-глюкуронида, Gold Biotechnology). После удаления хлорофилла 70% этанолом ткани, окрашенные GUS, очищали в растворе, содержащем 20% молочной кислоты и 20% глицерина.Паттерны экспрессии GUS были визуализированы с помощью препаровального микроскопа Olympus SZX12 с использованием программного обеспечения SPOT Advanced imaging software.

Коиммунопреципитация (co-IP) и вестерн / дальний вестерн-блоттинг

Микросомальные белки растений получали, как описано ранее [62]. Анализ Co-IP и вестерн-блоттинг проводили, как описано ранее, за исключением того, что для вестерн-блоттинга использовали трис-буферный солевой буфер (TBST, 0,05% твин 20, pH 7,6) [18]. Фар-вестерн-блоттинг выполняли, как описано ранее [32].Слитые белки GST-14-3-3 обнаруживали с помощью конъюгированного с HRP антитела против GST (GE Healthcare Life Sciences). Белки определяли с использованием субстратов максимальной чувствительности SuperSignal West Pico или West Femto (Thermo Scientific).

Двухгибридные дрожжи и анализы комплементации

Дрожжевую двугибридную систему на основе lexA с использованием плазмиды-приманки pBTM116 и плазмиды-жертвы pACT2 [63] использовали для исследования взаимодействий фосфатаз SAUR19 и PP2C.D. pBTM116-SAUR19 и pACT2-PP2C.Плазмиды D котрансформировали в штамм дрожжей L40ccU3 [ MATa , his3-200 , trp1-901 , leu2-3 , 112ade2 LYS2 :: (lexAop) 4-HIS3 , , URA :: (lexAop) 8-lacZ , GAL4 , gal80 ] [63], высевали на подходящую среду для селекции и выращивали при комнатной температуре в течение 3–6 дней.

Saccharomyces cerevisiae штамм RS-72 ( MATa , ade1-100 , his4-519 , leu2-3 , 312 , GAL1pro : PMA1 : PMA1 ) AHA2 Конструкция в экспрессионной плазмиде pMP1745 была описана ранее [40]. ПП2С . Д1-9 , ПП2С . I1 и PP2C . F9 Полноразмерные кДНК клонировали в сайт Not I вектора экспрессии pMP1612 [40]. Все плазмиды вводили в дрожжевой штамм RS-72 путем трансформации ацетатом лития. PMA1 тесты комплементации были выполнены, как описано ранее [18].

In vitro Анализы дефосфорилирования AHA2

Модели 6xHis-SAUR9 и 6xHis-PP2C . D1 Конструкции в векторе экспрессии pET32 были описаны ранее [18]. Полноразмерные кДНК PP2C . D2 и PP2C . D5 в pENTR / D-TOPO были рекомбинированы в pET32-GW с использованием смеси ферментов Gateway LR clonase II для получения 6xHis-PP2C . D2 и 6xHis-PP2C . D5 бактериальные экспрессирующие конструкции. Экспрессию и очистку рекомбинантных белков, меченных His, и анализы дефосфорилирования AHA2 проводили, как описано ранее [18].

Количественная RT-PCR

РНК получали из проростков с использованием набора RNeasy Plant Mini (Qiagen) или Nucleospin RNA Plant (Macherey-Nagel), и была включена обработка ДНКазой на колонке для удаления загрязняющей ДНК. Два микрограмма РНК использовали для синтеза кДНК с использованием обратной транскриптазы вируса мышиного лейкоза Молони (M-MLV) (Promega). Реакции qRT-PCR проводили на системе LightCycler (Roche Applied Sciences) с использованием SYBR Green JumpStart Taq Ready Mix (Sigma-Aldrich) или StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems) с использованием Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master. Смесь (Agilent Genomics).Праймеры для qRT-PCR были описаны ранее [18, 36], и результаты были основаны на трех биологических повторностях.

Анализы бимолекулярной флуоресценции (BiFC)

Полноразмерные последовательности кДНК без стоп-кодонов PP2C . D2 , D5 и D6 были клонированы в pENTR / D-TOPO. Эти вставки были впоследствии рекомбинированы в векторы-получатели pSPYNE и pSPYCE [64] с использованием смеси ферментов Gateway LR Clonase II Enzyme Mix для создания экспрессионных конструкций BiFC.Экспрессионные конструкции AHA2 и AUX1 BiFC были описаны ранее [18]. Все бинарные векторы вводили в штамм Agrobacterium GV3101 (с вспомогательной плазмидой pMP90) путем электропорации. Анализы BiFC проводили в системе временной экспрессии Nicotiana benthamiana , как описано ранее [65]. Для инфильтрации использовали листья растений Nicotiana benthamiana возрастом ~ 5 недель. Раствор для инфильтрации содержал 10 мМ MgCl ₂, 10 мМ MES-KOH (pH 5.6) и 150 мкМ ацетосирингона. Флуоресцентные сигналы в эпидермальных клетках листа наблюдались через три дня после инфильтрации. Конфокальная микроскопия выполнялась на спектральном конфокальном микроскопе Nikon A1.

Проект Wise Wall

Проект Wise Wall в сельской деревне Саур в Уттаракханде в Техри Гарвал задокументировал уроки жизни целой деревни, а затем продемонстрировали коллективную мудрость через искусство на стенах деревня.

Саур — это отдаленная деревня с 600-летней историей, и считается, что здесь жила богиня Сурканда. Это как дно чаши, со всех сторон окружен горами. Саур на самом деле означает единения, и, как ни странно, это противоречие мир, потому что деревня столкнулась с массовой миграцией из-за годы.

Есть африканская поговорка: «Солнце не забывает деревня просто потому, что она маленькая.»Деревня Саур была назван деревней-призраком из-за чрезмерной миграции. Это один среди еще 1053 деревень Уттаракханда, в которых мало или совсем нет жителей больше нет, и поэтому их называют деревнями-призраками.

Инициатива Project FUEL спонсируется RoundGlass и поддерживается компании Due North уникальным образом обратилась к проблеме миграции в городские пространства. Инструменты, которые мы использовали, были простыми.Просто смесь нашей веры во всю человеческую мудрость и ударную волну изменения, которые искусство создает в сообществах по всему миру.

Мы предполагали, что проект The Wise Wall станет заявлением в сам. И Саур теперь первая деревня в новейшей истории, которая иметь задокументированную базу данных жизненных уроков целого Сообщество выставлено на внешней стороне каждой стены дома, включая заброшенные.

Деревня теперь превратилась в большой класс, где каждый стена — это доска, открывающая яркую, но простую жизнь учеба. Благодаря нашим инициативам в социальных сетях эти уроки будет продолжать повышать осведомленность и поощрять посторонних / город жители ценить уроки, извлеченные из их часто игнорируемых корней.

Основа мобильных инноваций — инфраструктура | Кристиан Саур | Assembly Ventures

Без сомнения, автомобили многих типов будут важной частью нашего личного опыта мобильности в течение многих десятилетий, но мобильность становится мультимодальной.Варианты микромобильности растут, дроны не за горами, а мобильность в целом становится все более многогранной. Инфраструктура должна будет отражать это разнообразие режимов мобильности и реагировать на него.

Взлетать могут все, но кто может приземлиться?

Хотя дроны и другие виды воздушного транспорта еще не внедрены в наших городах, их шумиха существует. Их влияние, особенно на логистику, слишком разрушительно, чтобы исключить их из транспортных систем завтрашнего дня.Однако они еще не освоили свое пространство в городской среде. Отчасти это связано с отсутствием нормативных положений, запрещающих развертывание дронов в определенных областях и вызывающих вопросы ответственности в других. Но это еще и отсутствие инфраструктуры.

«Для взлета летательным аппаратам в первую очередь нужны места для приземления»
— Джонстон, Ридель, Садев (McKinsey 2020)

В городских центрах для людей с eVTOL, вероятно, потребуются более крупные конструкции, похожие на аэропорт. Они будут не только состоять из простой площадки вертикального взлета и посадки, но также, вероятно, будут иметь более сложные зоны регистрации и ожидания, что сделает их занимающими много места.Однако, предполагая, что эти eVTOL будут среди компонентов Mobility 4.0, развернутых последними (по сравнению, например, с микромобильностью), мы можем увидеть, как они перепрофилируют существующую инфраструктуру мобильности. Примерами могут быть дороги, парковочные сооружения в центрах городов или аналогичные пространства, которые стали ненужными из-за изменений в поведении пользователей.

Более насущный вопрос — как решить проблему доставки дронами. Хотя дроны могут сбрасывать посылки на заднем дворе в пригороде, этот подход неосуществим в центре города. Здания должны будут предоставить специальные зоны высадки, где дроны могут безопасно доставлять товары. В этом случае подходом может быть использование существующих упаковочных станций, которые объединяют поставки для блока. Вместо того, чтобы устанавливать только упаковочную станцию, где поставки блокируются для хранения до тех пор, пока получатель не заберет их, эти станции могут также иметь место для доставки дроном. В этом случае получателю может потребоваться принять доставку или позволить кому-то другому получить доставку вместо этого.В любом случае продумывание и взлета, и посадки — важный первый шаг к развертыванию городской воздушной мобильности.

Инфраструктура — объединение коллективного разума

С появлением автономных транспортных средств ожидания в отношении транспортной инфраструктуры изменятся — инфраструктура должна стать интеллектуальной. Небольших манипуляций с дорожными знаками (например, граффити) может быть достаточно, чтобы автономные транспортные средства неправильно их интерпретировали. Но в более общем плане, во время вождения люди могут смотреть за пределы того, что находится прямо перед ними, ожидая внезапного торможения или затора из-за интерпретации общего транспортного потока или своего опыта и рефлексов.Напротив, AV в настоящее время реагирует в соответствии с заранее определенными правилами, принимая решения на основе ограниченного числа параметров. Это технологически прагматичный подход, позволяющий ограничить вычислительную сложность и гарантировать, что антивирусные программы примут меры, пока не стало слишком поздно.

«Одной из самых сложных задач для автономных транспортных средств SAE уровней 4 и 5 является прогнозирование действий водителей-людей и реагирование на них. Для сравнения, действия других беспилотных транспортных средств почти наверняка будут предсказуемыми, а их намерения будут прозрачными для беспилотных транспортных средств, которые, скорее всего, будут постоянно общаться друг с другом, чтобы делиться информацией об условиях движения и координировать использование дорог »
— Sparrow and Howard (2017)

Инфраструктура, однако, может взять на себя здесь жизненно важную роль для расширения поля зрения транспортных средств. Вместо того, чтобы ожидать, что каждое транспортное средство будет взаимодействовать с каждым транспортным средством вокруг них, представьте систему, в которой каждое транспортное средство находится в постоянном обмене с интеллектуальной инфраструктурой вокруг него , получая всю соответствующую информацию от инфраструктуры, а не от других транспортных средств. Это может не только уменьшить накладные расходы на связь. Оборудовав инфраструктуру вычислительной мощностью, она может взять на себя задачи периферийных вычислений. В свою очередь, для транспортных средств потребуются менее мощные бортовые компьютеры, что снизит потребление энергии.Это может позволить производителям устанавливать батареи меньшего размера в свои автомобили или расширить диапазон, достижимый с данным размером батареи. Все это начинается с интеллектуальной подключенной инфраструктуры трафика, способной взять на себя локальные вычисления мобильности.

Подключение этих локальных вычислительных единиц также может иметь положительные эффекты, особенно для потока трафика. Зная об увеличении транспортного потока в определенном направлении, светофоры могут динамически корректировать свои интервалы, чтобы оптимизировать пропускную способность и уменьшить заторы.В другом сценарии светофор может передавать информацию в систему навигации автомобиля, позволяя соответствующим образом корректировать свой маршрут.

Как сделать коктейль Сауэр-микс в домашних условиях

Рецепт коктейля «Нью-Йорк сауэр»

Какие ингредиенты понадобятся

Как необходимо смешивать

Рецепт сауэр-микса «Юбилейный»

Какие ингредиенты понадобятся

Как необходимо смешивать

Рецепт коктейля «Whiskey sour»

Какие ингредиенты понадобятся

Как необходимо смешивать

Рецепт сауэр-микса «Томми Ди»

Какие ингредиенты понадобятся

Как необходимо смешивать

Рецепт сауэр-микса «Восточный экспресс»

Какие ингредиенты понадобятся

Как необходимо смешивать

Рецепт сауэр-микса «Ревень-ириска»

Какие ингредиенты понадобятся

Как необходимо смешивать

Рецепт сауэр-микса «Кабинет»

Какие ингредиенты понадобятся

Как необходимо смешивать

Рецепт сауэр-микса «Лавандовый пирог с меренгой»

Какие ингредиенты понадобятся

Как необходимо смешивать

Рецепт сауэр-микса «Завтрак с текилой»

Какие ингредиенты понадобятся

Как необходимо смешивать

Рецепт сауэр-микса «Висмут»

Какие ингредиенты понадобятся

Как необходимо смешивать

Видео приготовления различных сауэр-миксов

Другие похожие напитки

Классический техасский чай рецепт | Гранд кулинар

Ингредиенты к рецепту:

Сауэр-микс

Классический техасский чай

Простой сахарный сироп

Приготовление блюда по рецепту:

Сироп Sauer Mix — Коктейльная карта

Сиропы для коктейлей или коктейли для сиропов?

Коктейли :: Ресторан Баку

Калорийность Коктейль, виски сауэр, микс, бутилированный. Химический состав и пищевая ценность.

Пищевая ценность и химический состав

Cuba libre

масляных красок и медиумов — Jill Saur Fine Art

Асимметричная экспрессия генов SAUR, опосредованная ARF7 / 19, способствует гравитропизму и фототропизму растительных гипокотилей

Основные моменты

Резюме

Ключевые слова

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Загрузить Lagu Saur Get (5,52 МБ) (04:01)

вирусного тербару !!! лагу сахур 3 ирама, пемуда аче багункан сахур !!!!! пемуда компак

BANGUN DONG SAHUR..SAHUR .. !! TRUCK TAWAKAL # 3 BANGUNIN SAHUR PAKE SOUND SISTEM.Ets2

Woww keren .. Para Pemuda Kreatif ini menciptakan lagu AYO KITA SAHUR | РАМАДАН АСЫК ..

Общественный ответ о загрузке Lagu Saur

Мам, ты делаешь мое сердце Саур! ДЛЯ ВСЕХ ВОЗРАСТОВ — суббота, 8 мая 2021 г.

Подмножество фосфатаз PP2C.D, локализованных в плазматической мембране, негативно регулируют SAUR-опосредованную экспансию клеток у Arabidopsis

Введение

Результаты

Белки PP2C.D демонстрируют четкую субклеточную локализацию

Субпопуляция белков PP2C.D, локализованная в плазматической мембране, ингибирует рост клеток

Фосфатазы PP2C.D взаимодействуют с SAUR19 и PM H

Ауксин индуцирует экспрессию подмножества

Обсуждение

Материалы и методы

Растительный материал и условия роста

Статистический анализ

Анализ фототропизма

Линии трансгенных растений

Анализы GUS

Коиммунопреципитация (co-IP) и вестерн / дальний вестерн-блоттинг

Двухгибридные дрожжи и анализы комплементации

Количественная RT-PCR

Анализы бимолекулярной флуоресценции (BiFC)

Проект Wise Wall

Основа мобильных инноваций — инфраструктура | Кристиан Саур | Assembly Ventures

Взлетать могут все, но кто может приземлиться?

Инфраструктура — объединение коллективного разума