Зарядить по составу: Страница не найдена

Разбор слов по составу

Разбор слова по составу

Тип лингвистического анализа, в результате которого определяется структура слова, а также его состав, называется морфемным анализом.

Виды морфем

В русском языке используются следующие морфемы:

— Корень. В нем заключается значение самого слова. Слова, у которых есть общий корень, считаются однокоренными. Иногда слово может иметь два и даже три корня.

Важность морфемного разбора

В русском языке разбор слова по составу очень важен, ведь нередко для правильного написания слова необходимо точно знать, частью какой морфемы является проверяемая буква. Многие правила русского языка построены на этой зависимости.

Пример

В качестве примера можно взять два слова: «чёрный» и «червячок». Почему в первом случае на месте ударной гласной мы пишем «ё», а не «о», как в слове «червячок»? Нужно вспомнить правило написания букв «ё», «е», «о» после шипящих, стоящих в корне слова. Если возможно поменять форму слова либо подобрать родственное ему так, чтобы «ё» чередовалась с «е», тогда следует ставить букву «ё» (чёрный — чернеть). Если чередование отсутствует, тогда ставится буква «о» (например, чокаться, шорты).

В случае же со словом «червячок» «-ок-» — это суффикс. Правило заключается в том, что в суффиксах, если стоящая после шипящих букв гласная находится под ударением, всегда пишется «о» (зрачок, снежок), в безударном случае — «е» (платочек, кармашек).

Как разобрать слово по составу

Для помощи начинающим существуют морфемно-орфографические словари. Можно выделить книги таких авторов, как Тихонов А.Н., Ожегов С.И., Рацибурская Л.В.

В любом слове непременно должны присутствовать корень и основа. Остальных морфем может и не быть. Иногда слово целиком может состоять из корня (или основы): «гриб», «чай» и т.д.

Этапы морфемного анализа

Чтобы морфемный разбор слов было легче осуществить, следует придерживаться определенного алгоритма:

— Сначала нужно определить часть речи, задав вопрос к слову. Для прилагательного это будет вопрос «какой?», для существительного — «что?» или «кто?».
— Затем нужно выделить окончание. Чтобы его найти, слово нужно просклонять по падежам, если часть речи это позволяет. Например, наречие изменить никак нельзя, поэтому у него не будет окончания.
— Далее нужно выделить основу у слова. Все, кроме окончания, — основа.
— Потом следует определить корень, подобрав родственные однокоренные слова.
— Определяется приставка, а потом суффиксы (при их наличии).

Особенности разбора

Иногда подход к морфемному разбору в программах университета и школы может отличаться. Во всех случаях различия аргументированы и имеют право на существование. Поэтому стоит ориентироваться на морфемный словарь, рекомендованный в конкретном учебном заведении.

Производитель «Иволг»: заряжать телефоны в поездах безопасно

https://ria.ru/20200220/1565005713.html

Производитель «Иволг»: заряжать телефоны в поездах безопасно

Производитель «Иволг»: заряжать телефоны в поездах безопасно — РИА Новости, 20.02.2020

Производитель «Иволг»: заряжать телефоны в поездах безопасно

Заряжать телефоны в поездах «Иволга», которые в частности курсируют на Московских центральных диаметрах (МЦД), для данных телефона абсолютно безопасно, заявил… РИА Новости, 20.02.2020

2020-02-20T12:41

2020-02-20T12:41

2020-02-20T12:41

общество

трансмашхолдинг

/html/head/meta[@name=’og:title’]/@content

/html/head/meta[@name=’og:description’]/@content

https://cdn22.img.ria.ru/images/156126/77/1561267741_0:144:3384:2048_1920x0_80_0_0_e2b15be6da0ed85923923f6e6d43b4f1.jpg

МОСКВА, 20 фев – РИА Новости. Заряжать телефоны в поездах «Иволга», которые в частности курсируют на Московских центральных диаметрах (МЦД), для данных телефона абсолютно безопасно, заявил руководитель технического управления дирекции по развитию пассажирского транспорта «Трансмашхолдинга», который выпускает этот подвижной состав, Михаил Куприянов.Ведущий круглого стола в газете «Гудок» задал вопрос, касающийся безопасности данных на гаджетах, которые заряжаются в поездах «Иволга». Он привёл пример своего сына, который недавно сказал, что никогда не пользуется публичными USB-розетками в поездах, или на станциях, потому что это не просто зарядки: там вся информация с телефона скачивается.»У вас там нет жучков?» — спросил в шутку ведущий.По его словам, влезть в систему управления электропоездом с помощью своего мобильного устройства, каким-то образом подключиться или внести какие-то изменения или несанкционированные действия, невозможно.»Над этим мы поработали изначально, и поэтому уверяю, что заряжать мобильные устройства в электропоезде «Иволга» абсолютно безопасно», — отметил Куприянов.

https://radiosputnik.ria.ru/20191224/1562754632.html

https://ria.ru/20191211/1562291094.html

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

2020

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

Новости

ru-RU

https://ria.ru/docs/about/copyright.html

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

общество, трансмашхолдинг

Как зарядить шуруповерт с аккумулятором правильно

Все электрические шуруповерты делятся на 2 типа: сетевые и аккумуляторные. Сетевые получают питание от источника тока через розетку и кабель, а аккумуляторные – через батарею. В этой статье речь пойдет только об аккумуляторных шуруповертах, а именно, как правильно зарядить шуруповерт с батареей того или иного типа.

Типы аккумуляторов

Химический состав устройства – одна из главных характеристик, которая определяет тип заряда. От металла, который используется в аккумуляторе, зависит то, как правильно заряжать шуруповерт (правильная последовательность цикла заряда-разрядки), что продляет срок эксплуатации прибора. Все аккумуляторы в шуруповертах представлены тремя типами: литий-ионные, никель-кадмиевые и никель-металл-гидридные.

Литий-ионный аккумулятор

Считается одним из современных типов с использованием новейших технологий. Отличается достаточной емкостью батареи. Не имеет эффекта памяти и рассчитан на интенсивное и частое применение. Быстро заряжается, циклов зарядки насчитывается до 1000.

Однако литий-ионные модели отличаются высокой стоимостью и плохо работают при низких температурах: быстрее разряжаются и дают нестабильный поток энергии. Хранить такие батареи нужно в полуразряженном состоянии и периодически производить зарядку.

Никель-кадмиевый аккумулятор

Самый первый тип аккумуляторов, долго держит зарядку и имеет достаточно хорошую емкость. Однако имеет эффект памяти, который запрещает ставить на зарядку при неполном разряде батареи. Поэтому частая подзарядка недопустима, это ведет к сокращению емкости АКБ. Перед первым использованием также необходимо сначала полностью зарядить аккумулятор, а потом уже начать работу с инструментом.

Никель-кадмиевые аккумуляторы обычно используются в шуруповертах бюджетного класса из-за выгодной цены и оптимального режима нечастого использования.

Никель-металл-гидридный аккумулятор

Этот тип пришел на смену никель-кадмиевым, он более экологичен и легче по весу. Однако он хуже сохраняет зарядку в спокойном режиме и может быстро снизиться емкость батареи. Поэтому агрегат желательно ставить на зарядку перед каждым применением и всегда брать с собой зарядное устройство.

Как правильно зарядить аккумулятор шуруповерта

Очень важным этапом является первая зарядка аккумулятора после покупки инструмента. Она влияет на то, будет ли активной вся емкость батареи. Каждый тип аккумулятора имеет свои характерные черты первого заряда.

Литий-ионные первый раз можно заряжать до любого уровня, так как они не имеют эффекта памяти.

Никель-кадмиевые имеют сложный процесс первой зарядки: их следует подзаряжать 3 раза подряд до заполнения всей емкости, а только потом включать в работу.

Никель-металл-гидридные сперва нужно разрядить целиком, а потом зарядить по максимуму. Следует выполнить 5 таких полных циклов

Сколько времени нужно для зарядки аккумулятора

Перед тем, как зарядить аккумуляторную дрель или шуруповерт, нужно определить, сколько времени потребуется для этой процедуры. Как правило, период прописан в инструкции, прилагающейся к инструменту. Некоторые модели аккумуляторов имеют световую индикацию, которая показывает, когда прибор полностью заряжен. После завершения зарядки сразу же отсоедините батарею от зарядного устройства.

Обычно время заряда составляет от получаса до 7 часов, в зависимости от типа самой батареи и зарядного устройства. Дольше всего подпитываются энергией никель-кадмиевые аккумуляторы – 3-7 ч.

Влияние внешних факторов на аккумулятор

В этом разделе представлена подробная информация, как правильно заряжать аккумулятор шуруповерта и использовать оборудование в условиях улицы. Несмотря на то, что к каждой модели шуруповерта прилагается инструкция, есть общие правила применения аккумуляторных инструментов вне помещения:

1. Процесс заряда аккумулятора должен осуществляться в особом температурном режиме: от +10⁰ до +35⁰ С. Нежелательно заряжать АКБ на холоде при температуре ниже +5⁰ С.
2. Избегайте контакта самого инструмента или аккумулятора со влагой: дождем или снегом, высокой влажностью. Это может привести к развитию ржавчины и нарушению электропроводимости. В этом случае придется покупать новый прибор и потратить время на поиски подходящего аккумулятора.
3. Прямые солнечные лучи также вредны для аккумулятора и всего инструмента в целом! Особенно летом, когда температура высокая. Это чревато перегревом устройства и нарушением контактов, ведь в результате высоких температур ионы металлов начинают вступать друг с другом в реакцию. Этот процесс не виден сразу, со временем вы обнаружите, что зарядка стала медленнее, а индикатор будет показывать всегда одно положение.

Типы зарядных устройств

Для шуруповертов существует 2 типа устройств для зарядки аккумуляторов:

• обычный;
• импульсный.

Обычные зарядные устройства занимают 3-7 часов на полную зарядку АКБ. Обычно используются с шуруповертами бытового класса, где емкость батареи не расходуется интенсивно и не требуется частая зарядка аккумулятора.

Импульсные приборы полностью заряжают аккумулятор менее чем за 1 час. Как правило, они идут в комплекте к профессиональным моделям с высокой мощностью, которые используются непрерывно в течение долгого времени и требуют быстрой подзарядки сменной батареи.

Помимо этого, не забудьте проверить совместимость зарядного устройства и вашей электросети. Необходимое напряжение для прибора должно быть прописана в инструкции к нему. Если показатели не совпадают и напряжение самой сети выше, чем нужно, то следует использовать трансформатор или адаптер, чтобы компенсировать дисбаланс. Иначе может произойти короткое замыкание или устройство просто перегорит. Наличие предохранителя внутри прибора просто не позволит ему зарядить аккумулятор.

Как зарядить аккумулятор шуруповерта без зарядного устройства

Существуют нестандартные методы, как зарядить шуруповерт без зарядного устройства: зарядка от автомобиля, от универсального зарядного устройства или от внешнего источника энергии. Эффективность таких действий, возможно, высока, если нет под рукой фирменного зарядного устройства, но безопасность аккумулятора при этом сомнительна, так как может привести к перезарядке аккумулятора. Мы не рекомендуем использовать данные методы, так как они могут не только привести к выходу из строя или поломке самой аккумуляторной батареи, но и попросту опасны для человека. Лучше приобрести фирменный прибор той же марки, что и шуруповерт, или подходящий по характеристикам.

Убираем аккумулятор на хранение

Перед тем, как убрать прибор на хранение, следует выполнить некоторые действия в зависимости от типа вашего аккумулятора.

Литий-ионные не имеют эффекта памяти и их можно заряжать на любой стадии, однако не стоит допускать полного разряда, это может привести к отключению защитных контроллеров, которые предотвращают перегрузки. В результате этого аккумулятор в дальнейшем может не выдержать интенсивную эксплуатацию и выйти из строя. Поэтому на хранение литий-ионный аккумулятор нужно убирать с зарядом в 50% и периодически (раз в 1-2 мес.) доставать и подзаряжать его.

Никель-кадмиевые перед хранением разряжают практически полностью (до состояния нерабочего инструмента). Чтобы убрать аккумулятор на долгое хранение (более 6 месяцев), следует выполнить от 3 до 5 полных курсов заряда-разрядки. Хранить так же в разряженном состоянии.

Никель-металл-гидридные больше остальных типов подвержены быстрому саморазряду, поэтому нужно постоянно поддерживать уровень зарядки и периодически ее восполнять. После длинного срока хранения нужно поставить АКБ на зарядку минимум на сутки, чтобы восполнить запасы энергии. Также отмечается снижение емкости после 300 циклов заряда-разрядки.

Смотрите также:

БАД Faberlic Драже жевательное «NewtonIQ» — «Можно ли зарядить интеллект? Разбираем состав драже от Faberlic»

Всем доброго времени суток!!!

Совсем недавно мне в руки попала интересная баночка, которая вызвала противоречивые чувства.

Это драже жевательное «Ньютоник» Заряд интеллекта от компании Faberlic.

Почему противоречивые?

Ну во-первых как зарядить интеллект? А если его нет)))))

А если заряжать, не вредно ли это?

Драже находятся в пластиковой баночке.

Всего их 30 штук .

Судя по описанию производителя, основные драже:

• Способствует улучшению мозгового кровообращения.
• Помогает сохранять концентрацию и внимание.
• Благотворно влияет на нервную систему.
• Компоненты, входящие в состав продукта, обладают высокой эффективностью. Помимо решения конкретных задач, каждое средство положительно воздействует на организм в целом.

Принимать их производитель советует 1-2 разв в день по 1 штуки.

Я принимала по одной, так мне хватило как раз на месяц (как бы курс).

Изначально драже были заклеены защитной фольгой.

Сами драже белого цвета. Без яркого запаха…точнее совсем без запаха. Они большие, чтобы проглотить. А вот разжевывая, остается не очень приятное послевкусие.

Ну а теперь к самому интересному-составу.

фруктоза, мальтодекстрин, усилитель вкуса и аромата глицин, регулятор кислотности янтарная кислота, витаминный премикс (витамины: Е, В1, В2, В6, В12, А, С, никотинамид, фолиевая кислота, пантотеновая кислота, биотин), экстракт ромашки, подсластитель сукралоза.

Сразу отмечу, продукт начал действовать не сразу, эффект стал заметен и ощутим после недели использования.

С утра уже нет желание убить кого-нибудь будильником. в течение дня отключается режим зомби. Обзоры на косметику формируются в моей голове намного быстрее.

Появились силы даже на вечернюю пробежку.

Я выделила несколько составляющих, о которых хочется написать поподробнее.

Янтарная кислота способствует выработке в организме человека основных аминокислот необходимых для мозга.

Оказывает положительное влияние на восстановление нервной и иммунной систем, повышает сопротивляемость организма к инфекциям.

Фолиевая кислота или витамин B9 cпособна предотвратить разрушение мозга болезнью Альцгеймера.

Также защищает мозг от разрушительных процессов происходящих в сосудах головного мозга и от аномалий мозга, называемых «интенсивностями белого вещества», связанных со снижением умственной деятельности.

Пантотеновая кислота или витамин В5. Участвует в передаче информации с помощью выработки нейротрансмиттеров в коре головного мозга, которые отвечают за вкус и обоняние. Их недостаток влияет на эти функции, вызывает ухудшение памяти.

Биотин или витамин В7.

Клетки нашего мозга, а еще вся нервозная система человека кормятся глюкозой. Биотин считается своеобразным катализатором для реакции участия глюкозы в обмене веществ.

Спасибо за прочтение.

Надо ли заряжать телефон до 100%?

Смартфон надо обязательно заряжать до 100% и разряжать до 0, чтобы сохранять подольше максимальную ёмкость аккумулятора — об этом часто говорят, но так ли оно на самом деле? В Музее истории телефона знают об аппаратах связи всё, в том числе и когда появилось это правило. 

Когда то телефоны нужно было разряжать до 0 и заряжать до 100, потому что аккумуляторы были никель-кадмиевые и обладали “эффектом памяти”. С тех пор аккумуляторы изменили состав — стали литий-ионными, ушёл и “эффект памяти”. Но многие по-прежнему стараются заряжать смартфон максимально — особенно в пути, например, за рулём — ведь у нас столько “прожорливых” в смысле энергии приложений. Только надо ли это делать?

Проведём опыт: лето, жара, а телефон заряжается в салоне авто. Доктор физико-математических наук Владимир Решетов запускает навигатор, видеозвонок, соцсети… Из-за одновременного заряда и расхода энергии гаджет греется. В день эксперимента было прохладно, поэтому поверхность, имитирующую приборную панель автомобиля, нагреваем с помощью плитки до 60 градусов (в жару она бывает и горячее). Кладем гаджет, продолжая заряжать и использовать, для чистоты эксперимента отключаем плитку. Глядя на тепловизор, можно подумать, что мы жарим телефон, но на самом деле — наоборот: гаджет блестящий, из-за этого прибор видит уменьшенное тепловое излучение, но точно показывает температуру матовой темной поверхности вокруг. В реальности смартфон горячее, а тепло снизу лишь не дает ему остывать. Чтобы доказать это, учёный разбивает яйцо.  Температура торпедо была недостаточной, чтобы получить яичницу, а на самом телефоне хорошо видно, что возникла белая корочка. Батарейка — самое уязвимое место современного телефона и именно она погибает при высоких температурах в первуюю очередь. Многие смартфоны о перегреве предупреждают и просят охлаждения, которое обычно решает проблему. Но что, если усилить воздействие — зарядить телефон до 100% под кондиционером, а потом бросить на жаре? В сети пишут, что может быть взрыв! Чтобы проверить, мы немного усугубили ситуацию: зарядили гаджет в холодильнике, накрыли колпаком и положили под горячий прожектор. Однако телефон так и не взорвался: миф из интернета о том, что батарейка в таких условиях опасно перезаряжается, опровергает и наш эксперт. Но и без жары попытки максимально зарядить могут закончиться плохо: пользователи в сети показывают свои сгоревшие именно от этого телефоны. Так бывает при поломке контроллера, который должен вовремя остановить заряд. Мы ещё для одного своего опыта заранее вывели этот элемент из строя, чтобы “аппетит” смартфона ничто не ограничивало, и заряжали — очень долго. Похоже, если нет редкого заводского брака, аппарату и в этих условиях ничего не грозит. Лишь при подключении очень мощного источника питания (обычно таким запускают автомобили) аккумулятор загорелся — при подаче тока силой 100 ампер вместо допустимых для телефона двух.

Итак, заряжать до 100 вполне безопасно. Но надо ли расходовать энергию до нуля? В интернете очень популярен запрос “телефон разрядился и не включается”, но почему так происходит?

Батарее надо всегда сохранять небольшой заряд, чтобы поддерживать жизнеспособность системы. Но если телефон сел и отключился, а пользователь снова запускает его, чтобы отправить важное сообщение или позвонить, а потом ещё аппарат долго лежит без зарядки, из аккумулятора выкачиваются последние соки. 

Разряд до 0 современному смартфону не нужен, порой это, наоборот, губительно для батареи. Эксперты советуют поддерживать запас энергии в аккумуляторе не ниже 40%. В идеале ещё и не доводить до 100 — именно жизнь в диапазоне от 40 до 90, по мнению большинства специалистов и согласно рекомендациям производителей, максимально продлевает жизнь батареям современных смартфонов. И не стоит включать телефон в розетку, когда запущены тяжелые приложения — это приводит к нагреву, который для аккумулятора хуже всего. 

Благодарим за помощь в съёмке сюжета:

• Парусный клуб «Водник» — любимое место отдыха нашей программы, один из самых известных клубов, взрастивший множество профессиональных спортсменов, почитаемый любителями романтичного и активного отдыха среди волн за гостеприимство, предоставление живописной локации и всестороннюю помощь
• Постоянного эксперта нашей программы, доктора физико-математических наук «Института лазерных и плазменных технологий» НИЯУ МИФИ Владимира Решетова, проводившего эксперимент, за высочайший профессионализм и преданность науке
• Сервисного инженера Сергея Шишкина за профессиональную поддержку — опыт работы  — с  2007 года. Сергей ремонтирует буквально все виды бытовой техники, а особенно — платы управления  на компонентном уровне
• Самый лучший магазин «Рыбка Дома», где есть красоты на любой вкус — рыбки, растения, улитки, креветки, аквариумы, декор, корма и многое другое за предоставление чудных рыбок для съёмок и украшения сюжета
• Музей телефонов, фонды которого представляют собой крупнейшее в Европе собрание раритетных телефонных аппаратов и аксессуаров конца XIX – середины ХХ веков, за интересное погружение в историю, качественное интервью и очень приятное сотрудничество
• Midea — производителя крупной бытовой техники номер 1 в мире за предоставление холодильника MR1049S, компактные размеры которого позволят установить его где это действительно удобно, для съемок программы @midea_rus
• Постоянного партнера — компанию «Тэсто Рус», производящую портативные и стационарные измерительные приборы, за надёжное партнёрство, высокое качество продукции и  предоставление тепловизора для съёмок программы

Полный выпуск «Чуда техники с Сергеем Малозёмовым» от 4 октября доступен по ссылке.

Все полные выпуски программы «Чудо техники» находятся здесь

Что можно сделать, если смартфон медленно заряжается

Со временем скорость зарядки смартфона может снизиться, что не может не раздражать его владельца, особенно когда предстоит длительная поездка, ждать 100% нет времени, а заряженный гаджет нужен прямо сейчас. Как оказалось, причин этому может быть несколько, и большинство из них не связаны со сроком службы и износостойкостью аккумулятора. Как решить эту проблему, не покупая новый смартфон — в материале «Газеты.Ru».

Если вам кажется, что ваш смартфон начал заряжаться медленнее обычного, то это может быть не разыгравшееся воображение, а суровая реальность. Как сообщает портал Business Insider, существует большое количество причин, почему устройству требуется больше времени на подзарядку, чем раньше, но большинство из них легко исправить. При этом пользователю не потребуется ни замена аккумулятора, ни покупка нового гаджета.

Так, если вы пользуетесь беспроводным зарядным ковриком, а не стандартным кабелем, это может сильно влиять на скорость подзарядки.

Дело в том, что мощность подобного девайса ниже, в сравнении с USB-шнуром, поэтому если вы торопитесь, имеет смысл воткнуть свой смартфон в сеть.

При этом важно проверить кабель, которым вы пользуетесь. Даже если на нем отсутствуют явные физические повреждения, он может быть испорчен внутри под оплеткой. Проверить этот факт можно простым способом — подключив смартфон с помощью другого кабеля. Если он начал заряжаться быстрее, то первый шнур явно дефективный.

Особенно остро эта проблема стоит у пользователей iPhone — многие из них жалуются, что кабель Lightning постоянно ломается на местах сгиба, но не спешат его заменить из-за высокой стоимости относительно обычных USB-шнуров для Android. В результате скорость зарядки снижается, а пользователь может даже не подозревать, что тому виной поврежденный кабель.

Чтобы ускорить зарядку, рекомендуется использовать адаптер питания, который подключается напрямую в розетку, а не заряжать смартфон от компьютера или другого электронного устройства.

В среднем зарядка гаджета «от стены» является в пять раз более эффективной, чем зарядка от ноутбука или планшета.

Однако и в этом случае необходимо подходить к процессу с умом. Дело в том, что не все адаптеры одинаковы — их мощность отличается друг от друга. Если вы используете адаптер от устаревшего гаджета с более новым устройством, есть вероятность, что скорость зарядки будет ниже, чем от адаптера, который поставлялся со смартфоном в комплекте. Мощность адаптеров увеличивается вместе с выходом новых моделей гаджетов, поэтому эксперты рекомендуют обновлять устройства для подзарядки одновременно с новым телефоном.

Если вам нужно зарядить телефон как можно скорее, то будет нелишним полностью выключить его.

Пользование смартфоном во время подзарядки, особенно если речь идет об энергоемких процессах, снижает скорость восстановления заряда аккумулятора.

Также существует небольшая вероятность того, что проблема кроется в зарядном порте на самом устройстве. Он может быть сломан — тогда его необходимо будет отремонтировать, а может быть загрязнен. В последнем случае можно воспользоваться зубочисткой для приведения его в порядок — тогда скорость зарядки также может увеличиться.

— Схема композиции объяснена в соответствии с GST

В этой статье мы рассмотрели некоторые из основных вопросов, касающихся схемы составления налогов в соответствии с Законом о налогах на товары и услуги.

Последние обновления схемы композиции

28 мая 2021 года
В соответствии с результатами 43-го заседания Совета GST и уведомлением CBIC,
(1) было предоставлено освобождение от процентов за подачу CMP-08 за январь-март 2021 года, в соответствии с которым, в случае любой задержки, проценты не взимаются до 3 мая, тогда как 9% сниженных процентов будут взиматься, если подача документов будет произведена после этого до 17 июня, и 18% позже.
(2) Срок подачи файла GSTR-4 на 2020-2021 финансовый год продлен до 31 июля 2021 года.
(3) Максимальный штраф за просрочку платежа для GSTR-4, который может взиматься, будет ограничен до 500 рупий за возврат для нулевой подачи и рупий. 2000 г., если не указано иное.

1 мая 2021 г.
(1) Срок подачи GSTR-4 на 2020-2021 финансовый год был продлен с 30 апреля 2021 г. до 31 мая 2021 г.
(2) Форма CMP-08, срок подачи которой истек до 18 апреля 2021 г. на январь-март 2021 г. дано смягчение процентных ставок.Нет процентов за подачу до 8 мая включительно, процентная ставка снижена до 9% в период с 9 мая по 23 мая, но после этого взимается 18%.
(3) Срок подачи ITC-03 лицами, недавно избранными по составу налога, на 2021-22 финансовый год продлен до 31 мая 2021 года.

21 сентября 2020 года
Плата за просрочку платежа была снижена при подаче ожидающей формы GSTR -4 (Ежеквартальный доход). Налогоплательщик не обязан уплачивать штраф за просрочку платежа, если налоговое обязательство составляет «ноль». В других случаях штраф за просрочку был ограничен до рупий.500.

Тем не менее, ожидающая рассмотрения GSTR-4 (квартальная), относящаяся к 2017-18 и 2018-19 финансовым годам, должна быть подана не позднее 31.10.2020.

31 августа 2020 года
Срок подачи формы GSTR-4 на 2019-20 финансовый год с 31 августа 2020 года по 31 октября 2020 года.

21 июля 2020 года
Объект для подачи GSTR-4 (годовой отчет ) теперь доступен на портале GST.

13 июля 2020 г.
Срок подачи GSTR-4 (годовой доход) продлен до 31 августа 2020 г. с 15 июля 2020 г.

3 апреля 2020 года
1. Срок для участия в схеме состава на 2020-2021 финансовый год по форме CMP-02 был продлен до 30 июня 2020 года. Это касается обоих налогоплательщиков, зарегистрированных в соответствии с разделом 10 CGST Act, а также налогоплательщики, выбирающие схему, уведомленную посредством уведомления CGST (Ставка) № 2/2019 от 7 марта 2019 г.
2 . Срок подачи формы ITC-03 соответственно продлен до 31 июля 2020 года.
3. Дилеры могут подать отчет по форме CMP-08 за квартал с января по март 2020 года до 7 июля 2020 года.
4. Срок подачи дилерами по составу годовой отчетности GSTR-4 за 2019-20 финансовый год продлен до 15 июля 2020 года.

Давайте рассмотрим некоторые из распространенных вопросов о схеме композиции, которые следует знать компаниям.

1. Кто может выбрать схему композиции?

Компании с годовым оборотом до 1,5 крор рупий могут выбрать композиционную схему. Оборот всех предприятий с одним и тем же PAN должен быть суммирован для расчета оборота с целью составления схемы.

Только производители товаров, дилеры и рестораны (не предлагающие алкоголь) могут выбрать схему состава в соответствии с разделом 10. Однако поставщики услуг могут выбрать аналогичную схему для дилеров состава, уведомленных уведомлением CGST (ставка) №

. 2/2019 от 7 марта 2019 года, где общий лимит оборота составляет 50 лакхов.

2. Какая ставка налога применяется к лицу, облагаемому составом?

Воспользуйтесь приведенной ниже таблицей, чтобы понять ставку налога с оборота в штате, а именно:

Схема составления: применимая ставка НДС

3. Покрывается ли обязательство по уплате налогов в соответствии с Механизмом обратного взимания сборов в рамках Композиционной схемы?

Продавец композиции должен платить налог в соответствии с механизмом обратной начисления, где это применимо. Ставка, применяемая к расходным материалам, — это ставка, по которой должен быть оплачен GST.Это означает, что ставка по схеме составления не должна использоваться для целей обратного начисления. Кроме того, предварительный налоговый кредит не предоставляется для налога, уплаченного по обратному начислению для дилера композиции.

4. Я покупаю товар у незарегистрированного дилера. Мне нужно платить налог?

Налог по обычным ставкам должен уплачиваться за покупки у незарегистрированного дилера только в течение июля и августа 2017 года. С сентября 2017 года нет необходимости платить налог на эти покупки, за исключением случаев, когда налогоплательщик занимается недвижимостью.Строители обязаны платить налог в размере 18% в обратном порядке за любую недостачу, превышающую 80%, при покупках у поставщиков, зарегистрированных в GST. По налогу, уплачиваемому по обратному начислению, ITC недоступна.

5. Должен ли я платить IGST при межгосударственных покупках с обратным начислением?

IGST не должен оплачиваться дилером композиции. Дилер, который должен платить налог по обратному тарифу, импортировать услуги или покупать у незарегистрированного дилера, должен платить только CGST и SGST.

6. Как рассчитать сумму налога?

Торговец композициями обязан платить налог по определенной ставке со всех продаж. Кроме того, дилер должен уплатить налог по обратному начислению на указанные покупки, покупки у незарегистрированных дилеров и импорт услуг.

Это означает, что Общая сумма налога на товары и услуги = налог на поставки (за вычетом аванса и возвращенных товаров) + налог на транзакции B2B, где применяется обратный сбор, + налог на покупки B2B у незарегистрированных поставщиков, если применимо + налог на импорт услуг.

Ставка налога на операции по обратному начислению, покупка у незарегистрированного дилера и импорт услуг будет по нормальным ставкам, то есть ставкам, применимым к поставкам. Тарифы по композиционной схеме применимы только к продажам дилера композиции.

7. Следует ли продавцу композиции вести подробный учет?

Нет, от дилера, зарегистрированного по схеме составления налогов, не требуется вести подробный учет, как того требует обычный налогоплательщик.

8. Могут ли дилеры по составу использовать предварительный налоговый кредит?

Нет, продавцу композиции не разрешается использовать предварительный налоговый кредит в размере GST на покупки.

9. Может ли дилер по составу выставлять налоговые счета?

Дилер композиции должен выпустить Счет на поставку. Они не могут выставить налоговый счет. Это связано с тем, что налог должен оплачиваться дилером из собственного кармана. Дилер по составу не имеет права взыскивать GST с клиентов.

10.Какие возвраты должен подавать продавец композиции?

Облагаемое налогом лицо обязано платить налог ежеквартально в отчете за 2019-20 финансовый год, то есть CMP-08 вместо предоставления декларации, то есть GSTR-4.

Кроме того, частота подачи отчетов GSTR-4 была сделана ежегодной, начиная с 2019-20 финансового года, которая заменяет годовую отчетность GSTR-9A.

11. Может ли дилер по продаже композиций взимать налог с клиентов?

Нет, продавцу композиции не разрешается взимать с покупателя налог на композицию.

12. Может ли дилер, занимающийся межгосударственными поставками, выбрать композиционную схему?

Составная схема доступна только для дилеров, осуществляющих внутригосударственные поставки. Если дилер участвует в межгосударственных поставках, он должен отказаться от этой схемы.

13. Каковы были условия перехода, если бизнес переходит от схемы компоновки в рамках предыдущего налогового режима к обычному налогообложению по налогу на товары и услуги?

Налогоплательщикам, зарегистрированным по схеме составления налога на добавленную стоимость, разрешалось брать в кредит ресурсы на складе, полуфабрикаты или готовую продукцию, хранящуюся за день до дня отказа от схемы составления налогов.

14. Каковы условия использования начального кредита по запасам, находящимся во время перехода?

Ниже приведены условия, которые должны быть соблюдены налогоплательщиком для использования кредита на вводимые ресурсы во время перехода от схемы составления к обычной схеме:

• Затраты или товары будут использоваться для налогооблагаемых поставок.
• Кредит CENVAT мог быть востребован в предыдущем режиме. Однако по композиционной схеме на него нельзя было претендовать.
• ITC имеет право пользоваться услугами в режиме GST.
• У налогоплательщика есть счета предварительного налога, уплаченные по таким товарам.
• Счета-фактуры не должны быть старше одного года с 1 июля 2017 г. (т. Е. Не датированы до 1 июля 2016 г.)

15. Какая обработка входящего кредита используется при переходе от обычной схемы к схеме составления?

При переходе с обычной схемы на композиционную схему налогоплательщик обязан уплатить сумму, равную зачету предналога, в отношении ресурсов, находящихся на складе, в день, непосредственно предшествующий дате такого перехода.Остаток предварительного налогового кредита после выплаты такой суммы, если таковой имеется, который хранится в кредитном регистре, теряет силу.

16. Могу ли я выбрать схему композиции через год и отказаться от нее в следующем году?

Да, это возможно. Вы можете выбрать переключение между схемой композиции и обычной схемой в зависимости от вашей текучести. Однако вы должны иметь в виду, что это повлияет на способ выставления счетов и подачи деклараций. Заявление об изменении можно подать на портале GST.

17. У меня много филиалов. Будет ли схема композиции применяться к каждому из них в отдельности?

считается выбранной для всех предприятий, связанных с PAN.

18. Верно ли, что дилеры по составу могут продавать товар по более низкой цене, чем обычные дилеры?

Да. Дилеры по продаже композиций не могут взимать GST со своих продаж в накладной. Таким образом, конечный потребитель платит меньше денег, чем обычно.

19.Могу ли я подписаться на схему композиции в любое время в течение года?

Нет. Перед началом каждого финансового года зарегистрированный налогоплательщик должен подавать декларацию на портале GST. Это нельзя делать в любое время года. Форму CMP-02 необходимо использовать для выбора в схеме композиции (как поставщик товаров, так и поставщик услуг)

20. Что будет, если я выйду из схемы состава в середине года?

Когда дилер отказывается от схемы компоновки, все обычные правила применяются со дня отказа.Например, дилер по составу отказывается от схемы составления 15 октября 2020 года. Это означает, что дилер должен будет подать два документа CMP-08 за кварталы с июля по сентябрь и октябрь (15 дней). Дилер также должен будет подать GSTR-1 и GSTR-3B за период октября 2020 года (продажи с 15 октября до конца месяца).

Самое быстрое и продвинутое соответствие 2B в Индии

Увеличьте количество заявлений ИТЦ, используйте интеллектуальные проверки для исправления данных и завершите сопоставление 2B менее чем за 1 минуту

GST может быть под механизм обратного заряда

С момента введения 1 июля 2017 года налог на товары и услуги Индии (GST) объединил рынки страны в рамках единого налогового режима, заменив предыдущую систему множественных центральных и государственных налогов.Но принятие и соблюдение нового режима, похоже, отстают, в результате чего эксперты размышляют о дальнейших изменениях, поскольку правительство работает над устранением пробелов.

Последний ажиотаж? Что схема композиции GST может подпадать под механизм обратного заряда.

Концепция обратного начисления

Концепция начисления налога на основе обратного начисления не нова. Механизм обратного начисления существовал в предыдущем режиме налога на услуги. Однако концепция обратной начисления на поставку товаров нова.

В ходе обычной деятельности поставщик товаров или услуг обязан уплатить налог на поставку, но в случае обратного налогообложения вместо этого налогоплательщик должен платить налог. Таким образом, если поставщик, который не зарегистрирован в рамках GST, поставляет товары лицу, зарегистрированному в рамках GST, получатель платит GST непосредственно правительству.

Ранним уведомлением от 13 октября 2017 г. правительство приостановило до 31 марта 2018 г. действие обратных сборов за покупки, сделанные зарегистрированными лицами у незарегистрированных лиц.Это означает, что зарегистрированное лицо может пользоваться внутригосударственными поставками товаров и / или услуг от незарегистрированных лиц без какого-либо дневного лимита, который ранее был ограничен на уровне рупий. 5000.

Что такое композиционная схема?

Композиционная схема — это альтернативный метод взимания налога, предназначенный для мелких налогоплательщиков. Предприятия с годовым оборотом до 1,5 крор могут принять участие в схеме компоновки, уплачивая налог по фиксированной заранее установленной ставке со своего валового оборота, не используя льготы по предварительному налоговому кредиту.

В настоящее время согласно GST торговцы, производители и рестораны (безалкогольные напитки) могут выбрать схему состава. Ставка налога по схеме составления составляет 1 процент (0,5 процента центрального налога и 0,5 процента государственного налога) для торговцев и производителей и 5 процентов (2,5 процента центрального и 2,5 процента штата) для ресторанов. До октября 2017 года производители по этой схеме платили 2 процента (1 процент — центральный и 1 процент — штат), а торговцы и рестораны платили так же, как и сейчас.

Сборы доходов и проблемы правительства

Согласно данным, опубликованным Министерством финансов 24 января 2018 года, один крор налогоплательщиков зарегистрировался для GST, из них 17,11 лакхов выбрали схему составления налогов.

Недавно опубликованные данные показывают, что правительство собрало рупий. 86 703 крор GST за декабрь. Хотя эта цифра выше, чем сборы за ноябрь, цифры за квартал с июля по сентябрь 2017 года показывают только рупий.335,86 крор собраны с тех, кто выбрал сбор за композицию. Для многих экспертов это указывает на то, что схема композиции может работать не так, как хотелось бы.

Большинство людей, которые выбирают схему композиции, ниже рупий. Оборот 20 лакхов, и кажется, что некоторые занижают свои доходы и уклоняются от уплаты налогов. Таким образом, министр финансов Арун Джейтли, выражая озабоченность по поводу низких сборов GST, вновь ввел механизм обратной оплаты (RCM) в соответствии с разделом 9 (4) для тех, кто выбирает схему составления.

Правительство считает, что введение механизма обратных начислений в рамках схемы сократит случаи недекларированного дохода. Кроме того, механизм обратного начисления, вероятно, поможет правительству контролировать покупки, сделанные дилерами по составу, и поможет устранить утечку налоговых поступлений.

Воздействие с точки зрения соответствия

Соблюдение пересмотренной схемы составления, вероятно, окажется трудным, что, возможно, сделает схему составления менее привлекательной для налогоплательщиков.Вот почему:

1) Требования к отчетности будут расти, что станет проблемой для многих мелких налогоплательщиков. Ранее мелкие налогоплательщики отражали свой оборот отдельной строкой. Однако механизм обратной оплаты требует предоставления подробных сведений об обратной оплате в отдельных декларациях GST.

2) Продавцы композиционных материалов могут потерять конкурентное преимущество, которым они пользуются в настоящее время, из-за более низкой ставки налога. Кроме того, налоги по обратному начислению необходимо будет оплачивать из собственного кармана, что будет дополнительными расходами для предприятий.

3) Налогоплательщики по схеме составления налога не смогут зачесть налоги обратного сбора, которые они платят. В настоящее время дилеры по составу используют смягченные правила ведения бухгалтерских книг и записей. Однако, как только начнется обратная оплата, им придется вести бухгалтерский учет более систематически, что опять же добавит им проблем.

Несоблюдение требований отрицательно повлияет на рейтинг соответствия предприятий. Те, у кого более высокий рейтинг, могут ожидать, что их потребности будут приоритетными в сети GST (GSTN), в то время как низкий рейтинг вполне может указывать на проблемы с соблюдением, которые требуют более тщательного изучения.

Дилерам композиционных материалов необходимо будет подготовиться к решению возрастающих проблем, связанных с этим изменением, или перейти на обычную схему GST.

Avalara — опытный поставщик услуг приложений (ASP) и партнер авторизованных поставщиков GST Suvidha (GSP). Чтобы понять, как наше облачное приложение Avalara India GST может помочь вам с GSTR-1–9, свяжитесь с нами через https://www1.avalara.com/in/en/products/gst-returns-filing.html. .

Обязательство по уплате налогов в рамках RCM, охватываемое схемой составления налогов

«Схема составления налогов» — это альтернативный метод взимания налога, предназначенный для мелких налогоплательщиков.Если ваш бизнес небольшой, но недостаточно мал, чтобы быть освобожденным от налога на товары и услуги, вы можете использовать совокупный оборот вашей компании, чтобы получить право на участие в схеме сборов. Была предоставлена ​​упрощенная «Схема композиции»; vide S ection 10 Центрального закона о налогах на товары и услуги, 2017 («Закон CGST, 2017» ) для мелких налогооблагаемых лиц, не обладающих достаточными знаниями и опытом для соблюдения требований GST в отношении записей. и счета.

В настоящее время «Схема составления» доступна для тех, чей «совокупный оборот » в предыдущем финансовом году не превышал рупий. 150 лакхов . Для штатов особой категории ( Аруначал-Прадеш, Манипур, Мегхалая, Мизорам, Нагаленд, Сикким, Трипура) лимит составляет рупий 75 лакхов, всего . [См. Уведомление № 14/2019-Центральная налоговая от 7-3-2019 ].

Состав и предполагаемая схема — Ставка и лимит GST: —

[Закон о поправках к CGST, 2018 г.e.f. 01.02.2019 и Уведомление № 14/2019 — Центральный налог, от 07.03.2019 и Правило 7 и Уведомление № 02/2019 — Центральный налог (ставка) от 07.03.2019 ]

Срок действия: — Эти ставки применимы с с 1 апреля 2019 года по 01 ^st января 2020 года

Пороговое значение: — рупий. 1,50 кр (75 лакхов для особой категории) с 1 апреля 2019 г. по 01 ^st января 2020 г.

Примечание: Композитный дилер может предоставлять услуги в размере до 10% от оборота в предыдущем финансовом году или 5 лакхов, в зависимости от того, что больше, по цене 0.Ставка налога 5% CGST и 0,5% SGST (всего 1%).

Покрывается ли обязательство по уплате налогов в соответствии с Механизмом обратного взимания в рамках Композиционной схемы?

Композиционный дилер должен платить налог в соответствии с механизмом обратного взимания платы («RCM»), где это применимо. Ставка, применяемая к расходным материалам, — это ставка, по которой должен быть оплачен GST. Это означает, что ставка по схеме составления не должна использоваться для целей обратного начисления. Кроме того, нет ITC доступен для налога, уплачиваемого по обратному начислению для дилера композиции.

В соответствии с правилом 5 Центральных правил налогообложения товаров и услуг , 2017 лицо, реализующее право уплаты налога в соответствии с разделом 10, должно соблюдать следующие условия, а именно: —

(а)….

(b)….

(c)….

(d) он должен платить налог в соответствии с подразделом (3) или подразделом (4) раздела 9 в отношении входящих поставок товаров или услуг или того и другого;

Дилер, который может приобрести товар у незарегистрированного дилера, должен уплатить налог по обратному начислению с этой покупки.

Да: Нет такого ограничения по составу дилеров на приобретение товаров только у зарегистрированных дилеров. Таким образом, дилер по составу может приобретать товары у незарегистрированных дилеров. Но в соответствии с правилом 5 Центральных правил налогообложения товаров и услуг , 2017, он должен платить налог в соответствии с подразделом (3) или подразделом (4) раздела 9 Закона о CGST, 2017 г. товары или услуги или и то, и другое.

Следует отметить, что положение статьи 9 (4) Закона о CGST, 2017 г. i.е. RCM в случае покупок у незарегистрированного лица — . Действует до 12.10.2017 . Если стоимость внутригосударственных поставок товаров или услуг или обоих превышает 5000 рупий в день , то RCM применяется в соответствии с разделом 9 (4) Закона о CGST, 2017 [ Notification Notification . 8/2017-Central Tax от 28 ^-го июня 2017]

Поскольку освобождение, предусмотренное Уведомлением от 28 ^-го июня 2017 г., было частичным освобождением, поэтому центральное правительство решило внести поправки в в указанное Уведомление от 28 ^-го июня 2017 г. , чтобы предоставить полное освобождение в случае, если Внутригосударственные поставки товаров или услуг или и то, и другое получено зарегистрированным лицом от любого незарегистрированного лица.В связи с вышеизложенным, Центральное правительство в порядке осуществления полномочий, предоставленных подразделом (1) статьи 11 Закона о CGST, 2017, издало Уведомление № 38/2017-Central Tax от 13 ^th. Октябрь 2017 г. применяется с 13.10.2017.

В указанном Уведомлении от 13 ^-го октября 2017 г. центральное правительство удалило оговорку с по Уведомление от 28 ^-го июня 2017 г. , что ограничивает освобождение для RCM u / s 9 (4 ) Закона о CGST только до предела рупий.5,000 / — в день в случае стоимости внутригосударственных поставок товаров или услуг или того и другого.

В соответствии с Законом о CGST (поправка) 2018 г., положение раздела 9 (4) Закона о CGST от 2017 г. было изменено, и теперь обратный сбор в размере не применяется ко всем входящим поставкам , полученным от незарегистрированного поставщика. Есть некоторые конкретные услуги в сфере недвижимости, только к которым применимо предоставление RCM в соответствии с разделом 9 (4) Закона о CGST, 2017. [ См. Уведомление №07/2019-Центральный налог (ставка) от 29 марта 2019 г.].

Уведомление № 07/2019 — Центральная налоговая (ставка) от 29 ^-го марта 2019 года, вступает в силу с 1 ^-го апреля 2019 года.

Во исполнение полномочий, предоставленных Разделом 9 (4) Закона о CGST, 2017, центральное правительство уведомило зарегистрированное лицо и товары и / или услуги , которые будут подпадать под действие RCM, если они получены от незарегистрированных поставщиков. В связи с этим Центральное правительство издало Уведомление № .07 / 2019- Центральный налог (ставка) от 29 ^-го марта 2019 г. , который вступил в силу с 1 апреля 2019 г. и будет применяться к «Промоутеры» только для указанных ‘ расходные материалы .

В указанном Уведомлении от 29 ^-го марта 2019 г. , указаны три вида поставок , для которых «промоутер» должен уплатить налог по обратному начислению.

ПРИМЕЧАНИЕ :

В настоящее время обратный сбор составляет , не применяется ко всем входящим поставкам , полученным от незарегистрированного поставщика в соответствии с разделом 9 (4) Закона о CGST, 2017. В рамках Real Estate есть некоторые конкретные услуги, только в отношении которых предусмотрено RCM в соответствии с разделом 9 (4) Закона о CGST от 2017 года. Правительство, возможно, считает, что в отсутствие обратного начисления и с увеличением лимита состава это используется как способ уклонения от уплаты налогов.

GST может подпадать под действие RCM в соответствии с разделом 9 (4) Закона о CGST от 2017 года для тех, кто выбирает схему композиции, для предотвращения уклонения. Правительство считает, что введение RCM в рамках схемы сократит случаи недекларированного дохода. Кроме того, RCM, вероятно, поможет правительству отслеживать покупки, сделанные дилерами по составу, и поможет устранить утечку налоговых поступлений.

Сообщается, что в закон будут внесены поправки, позволяющие ввести RCM для тех, кто выберет схему композиции.

*****

Заявление об ограничении ответственности: Ничто, содержащееся в этом документе, не должно толковаться как юридическое мнение или точка зрения любого из авторов, и его содержание должно использоваться исключительно в образовательных целях.

Схема композиции может быть под механизмом обратного заряда

Индия, вероятно, перенесет схему композиции под механизм обратного заряда . Стало известно, что правительство внесет поправку в закон о налоге на товары и услуги на бюджетной сессии, чтобы ввести разрешающее положение, предписывающее механизм, когда оно сочтет необходимым.

Как это будет сделано — Закон будет изменен, чтобы ввести разрешающее положение для введения механизма обратной оплаты везде, где Правительство. хотеть. Думаю, что хотя бы в случае композиционной схемы должен быть обратный заряд.

Положение об обратных платежах, действие которого временно приостановлено, предназначалось только для незарегистрированной организации, поставляющей товары или услуги, или и то, и другое. При обратном начислении те, кто принимает товары или услуги, будут взимать и собирать налог на основе обратного начисления, обеспечивая его уплату.Согласно схеме состава те, у кого оборот до рупий. 1 крор может уплатить от одного до пяти процентов этой суммы в качестве налога. Он будет увеличен до рупий. 1,5 крор. Ставка налога на композицию составляет 1% для торговцев и производителей и 5% для ресторанов.

Дилер, зарегистрированный по схеме состава, не обязан вести подробный учет. Однако дилер должен подавать квартальный отчет GSTR-4 до 18 числа месяца после окончания квартала.

Кроме того, годовой отчет GSTR-9A должен быть подан до 31 декабря следующего финансового года.

Совет GST выразил озабоченность по поводу того, что сборы по схеме составления были низкими. Налог, уплачиваемый по схеме композиции, составляет всего рупий. 300 крор на данный момент от более чем 1,6 миллиона компаний, которые зарегистрировались для этого, что намекает на подозрение в крупномасштабном уклонении, потому что, если предприятия заявляют об обороте менее рупий. На 20 тысяч больше, чем зачем они вообще искали регистрацию. Они будут освобождены в любом случае.

Возможно, у Совета по GST возникло ощущение, что в отсутствие обратного сбора и с увеличением лимита состава он используется как способ уклонения от уплаты налогов.Налог, взимаемый с дилеров по составу, очень низкий, и многие из них декларируют менее рупий. Годовой оборот 20 лакхов. Следовательно, обратное начисление может помочь правительству контролировать покупки дилеров по составу и помочь устранить уклонение / утечку.

Совет GST может посчитать, что в закон необходимо внести поправки, чтобы разрешить наложение обратных сборов везде, где может иметь место значительное уклонение. Этот механизм обратного начисления будет препятствовать тому, чтобы они оставались в схеме компромисса, и дилеры могут перейти на обычную схему.

Как заполнить форму детального расчета затрат

Расчеты скорости пополнения баланса могут включать только прямые затраты.

Хотя основная «Обязательная форма запроса» должна быть заполнена и подписана для всех новых и обновленных запросов на пополнение баланса, подробные сведения о расчете ставки могут быть предоставлены либо с помощью вкладки «Сведения о ставке» в книге запросов, либо в другом формате, предоставляемом подразделением, если поскольку требуемая информация представлена ​​в ясной и точной форме с соответствующей степенью детализации, как указано ниже.

В обязанности отдела входит обеспечение точности информации, представленной в шаблоне, включая зарплаты, остатки средств и т. Д. Дополнительную информацию о том, что квалифицируется как прямые затраты, см. На странице «Ресурсы».

Трудовые отношения

Включает:

• Заработная плата и льготы для физических лиц, активно и непосредственно работающих над пополнением баланса
• Физические лица, включенные в тариф пополнения, должны быть назначены в поле диаграммы пополнения на основе процента, включенного в тариф
  • Пример — Если Джилл работает над пополнением баланса 50% времени, 50% ее зарплаты и пособий должны быть включены в ставку, и такой же процент ее времени должен быть назначен в поле диаграммы пополнения баланса.
• Пособия включаются по соответствующей ставке на основании фактических результатов и назначений.
  • Если это новое пополнение баланса или вы не уверены, какой процент использовать, перейдите на страницу «Ресурсы», где можно найти ссылку на «Управление льгот» для получения процентных сумм.

Не включать:

Административные или надзорные обязанности, которые уже включены в ставку возмещения косвенных затрат и обычно не включаются в расчет ставки пополнения.Исключения для включения этих затрат должны быть подтверждены и одобрены Финансовым анализом.

Материалы

Включает:

• Прямые затраты на определенные материалы, используемые для оказания услуги пополнения баланса
  • Пример — Для услуг по анализу включить химикаты или другие необходимые предметы

Не включать:

• Косвенные затраты на родовые материалы, которые не могут быть специально присвоены перезарядке
  • Пример — Для службы анализа не включайте стоимость ручек, используемых для маркировки результатов теста.

Оборудование

Включает:

• Если основное оборудование (то есть оборудование стоимостью более 5000 долларов США) используется исключительно для пополнения запасов, единицы могут включать амортизацию оборудования для возмещения стоимости этого оборудования.
• Для получения дополнительной информации см. Вкладку 4 — Как заполнить форму «Специальное оборудование для перезарядки».
• Компьютеры, периферийные устройства или другое оборудование стоимостью менее 5000 долларов США следует включить в «Прочие расходы», как описано ниже.

Не включать:

• Оборудование, приобретенное на федеральные или подарочные фонды или приобретенное другим отделом ID
• Оборудование с истекшим сроком полезного использования (определенным Управлением активами)
• Незакупленное оборудование

Прочие расходы

Включает:

• Прочие затраты, необходимые для перезарядки, включают такие статьи, как затраты на обработку третьей стороной или контракты на техническое обслуживание.
  • Включено в этот раздел на основании использования службой пополнения баланса. то есть, если затраты на техническое обслуживание связаны с оборудованием, не связанным исключительно с перезарядкой, то эти затраты на техническое обслуживание следует пропорционально рассчитать на основе процента использования оборудования службой перезарядки.
• Компьютеры, периферийные устройства или другое оборудование стоимостью менее 5000 долларов США
  • Там, где закупки оборудования включены, единицы обычно получают одобрение только на один год, потому что прямое списание значительного количества неамортизируемого оборудования вызовет будущие колебания ставок в последующие годы, что приведет к несоответствию ставки руководящим принципам университета.

Итого эксплуатационные расходы

Это сумма включенных затрат на оплату труда, материалов, амортизации и других затрат. Это общая годовая стоимость предоставления услуги.

Поправка на профицит / дефицит предыдущего года

• Рекомендации Мичиганского университета по пополнению баланса основаны на применении требования безубыточности Uniform Guidance (ранее A-21).
  • Остатки средств на пополнение счета не могут превышать +/- 5% годового дохода от пополнения баланса
  • Формула = Конечный остаток средств / Годовой доход
  • Пример: 525 долл. США / 2500 долл. США = 21.0% => Не соответствует
  • Пример: 50 долларов США / 2500 долларов США = 2% => Соответствует
• Если баланс вашего фонда превышает +/- 5% от безубыточности, часть этого баланса должна быть включена, чтобы увеличить или уменьшить ставку в зависимости от ситуации, чтобы довести баланс фонда до правильного уровня.
  • Для существенных остатков, которые не могут быть возмещены в течение одного года, единицам предоставляется три года для приведения баланса в соответствие. Единицы должны указать предполагаемый период восстановления в этой форме.
  • В дополнение к возмещению дефицита посредством корректировки ставки или вместо него единицы могут финансировать этот дефицит, полностью или частично, из своих дискреционных фондов.
  • Излишки остатков НЕ могут быть перенесены из поля диаграммы пополнения. Варианты возмещения излишков ограничиваются корректировкой ставок.

Единицы продукта или услуги

Это «Единица измерения», используемая для распределения затрат на пополнение баланса.Это также единица, которая будет указана в утверждении тарифа пополнения баланса. Как и с затратами; количество единиц должно быть указано на основе ожидаемой годовой суммы.

Единицы должны быть указаны целыми числами.

Пример: если перезарядка рассчитана на время исследователя, это могут быть часы. Другие примеры включают количество отчетов, распечаток, анализов и т. Д. Рядом со словом «Единица» укажите тип применяемой единицы, а затем задокументируйте количество годовых единиц, ожидаемых для использования при расчете нормы.

Ставка пополнения за единицу

Этот расчет делит общую стоимость на количество единиц для определения скорости пополнения баланса.

Тарифы могут включать не более двух десятичных знаков.

Предыдущая оценка

Укажите предыдущую ставку за услугу, если применимо.

GST: схема составления GST может подпадать под действие механизма обратного взимания, чтобы обуздать уклонение.

«Закон будет изменен, чтобы ввести положение, позволяющее вам задействовать механизм обратного взимания платы, где бы вы ни захотели», — сказал человек, знакомый с обсуждениями в Совете GST. «Думаю, что, по крайней мере, в случае компоновочной схемы нужно делать обратную зарядку.”

Согласно механизму обратной оплаты, лицо, получающее товары или услуги, собирает взимаемый налог на товары и услуги и депонирует налог в правительство. Это положение, действие которого временно приостановлено, предназначалось только для незарегистрированной организации, поставляющей товары или услуги, или и то, и другое. В таком случае те, кто принимает товары или услуги, будут взимать и собирать налог на основе обратного начисления, обеспечивая его уплату.

Согласно схеме компромисса, лица с оборотом до 1 крор рупий могут платить 1-5% от этой суммы в качестве налога и не должны подавать подробные декларации по налогу на товары и услуги. Эта сумма будет увеличена до 1,5 крор рупий. Ставка налога составляет 1% для торговцев и производителей и 5% для ресторанов.

Совет выразил озабоченность тем, что сборы по схеме составления были низкими.

Подозревается уклонение в крупном размере, поскольку налог, уплачиваемый по схеме компромисса, составляет всего 300 крор рупий на данный момент более чем 1,6 миллиона предприятий, которые зарегистрировались для этого. Этот человек спросил, если компании заявляют, что оборот составляет менее 20 тысяч рупий, зачем им вообще нужна регистрация. В любом случае они будут освобождены от уплаты налогов.

«Правительство, возможно, считает, что в отсутствие обратного начисления и с увеличением лимита состава это используется как способ уклонения от уплаты налогов», — сказал Пратик Джайн, руководитель компании PwC по косвенным налогам.«Кроме того, налог, взимаемый с дилеров по составу, очень низок, многие из них декларируют менее 20 лакхов годового оборота. Обратный платеж поможет правительству отслеживать покупки дилеров по составу и поможет устранить утечку ».

Эффективность поиска ДНК модулируется составом и распределением зарядов в собственно неупорядоченном хвосте

Abstract

Внутренне неупорядоченные хвосты распространены в ДНК-связывающих белках и могут влиять на их эффективность поиска на неспецифической ДНК, способствуя динамике брахиации межсегментного переноса.Во время брахиации белок перескакивает между удаленными участками ДНК через промежуточное состояние, в котором хвостовая и глобулярная части связаны с разными сегментами ДНК. В то время как неупорядоченный хвост должен быть длинным и положительно заряженным, чтобы облегчить поиск ДНК, влияние его последовательности остатков на брахиацию неизвестно. Мы исследовали эту проблему с помощью факторов транскрипции гомеодоменов NK-2 и Antp. Мы разработали 566 вариантов хвоста NK-2 и 55 вариантов хвоста Antp, имеющих разные чистые заряды и распределение положительных зарядов, и изучили их динамику и эффективность поиска ДНК с помощью крупномасштабного молекулярно-динамического моделирования.Больше межсегментных переносов происходит, когда хвост умеренно положительно заряжен, а положительные заряды сгруппированы вместе в середине хвоста или к его N-концу. Наличие отрицательно заряженного остатка не оказывает значительного влияния на брахиацию белка, хотя вполне вероятно, что присутствие многих отрицательно заряженных остатков усложнит механизм поиска ДНК. Биоинформатический анализ 1384 гомеодоменов дикого типа показывает, что состав и распределение зарядов в их последовательностях N-хвоста согласуются с оптимальным паттерном заряда, способствующим переносу между сегментами.Таким образом, наше исследование показывает, что последовательность остатков неупорядоченных хвостов ДНК-связывающих белков обладает уникальными характеристиками, которые были эволюционно выбраны для достижения оптимальной функции, и предполагает, что парадигма последовательность-структура-функция, известная для структурированных белков, применима также и для белков с внутренней неупорядоченностью. .

Общепризнано, что белковые сегменты или даже целые белки могут выполнять ключевые функции в клетке, не имея четко определенной третичной структуры (1–3).Эти внутренне неупорядоченные области многочисленны у эукариотических организмов и связаны в основном с регуляторными функциями (1–9). Аминокислотная последовательность внутренне неупорядоченных белков отличается от таковой глобулярных белков, поскольку первые богаты заряженными остатками, дефицитны по гидрофобным остаткам и имеют низкую степень сложности (10, 11). Тем не менее, неупорядоченные белки не лишены структуры (12-14), и недавние исследования показали, что они могут принимать коллапсированные структуры, в которых степень их уплотнения модулируется их суммарным зарядом (15-17).Взаимосвязь последовательность-структура-функция важна для структурированных белков, а также может быть важна в отношении белков с внутренней неупорядоченностью, о которых известно гораздо меньше. Чтобы понять эту взаимосвязь в изначально неупорядоченных белках, необходимо исследовать детерминанты последовательности и эволюционное сохранение их структуры и функции.

Ранее мы показали, что ДНК-связывающие белки имеют тенденцию иметь неупорядоченные хвосты: около 70% ДНК-связывающих белков имеют неупорядоченный хвост, в то время как только около 50% не связывающих ДНК белков имеют такой хвост (18).Хотя традиционно многие исследования были сосредоточены на свернутой области ДНК-связывающих белков для оценки сродства и селективности к ДНК, становится все яснее, что хвост нарушения модулирует несколько ключевых аспектов взаимодействий белок-ДНК (19). Связывание N-хвостов гомеодоменного белка, которые в растворе сильно заряжены и неупорядочены, в малой бороздке заставляет хвост складываться, хотя он также может оставаться гибким или частично неупорядоченным в комплексе (20). Несколько независимых доказательств указывают на тот факт, что неупорядоченные N-хвосты гомеодоменов вносят вклад в специфическую селективность последовательности ДНК (20-24).Однако было представлено лишь несколько гипотез относительно механизма, с помощью которого N-хвосты модулируют отбор мишени (19, 24–26). Недавно было показано, что неупорядоченные хвосты стабилизируют гомеодомен в присутствии ДНК, но дестабилизируют гомеодомен в ее отсутствие (26, 27). N-хвост гомеодоменов также способствует образованию специфических взаимодействий в ДНК-связывающем сайте и тем самым увеличивает кинетическую специфичность (27).

Неупорядоченный хвост ДНК-связывающих белков можно рассматривать как еще один субдомен, который неспецифически взаимодействует с ДНК (рис.1). Мы показали, в согласии с исследованиями кинетического ЯМР (28-30), что N-хвосты гомеодоменных белков могут значительно облегчить поиск ДНК (18). Притяжение положительно заряженного N-хвоста к ДНК может увеличить сродство белка к ДНК и, следовательно, увеличить долю поиска, предпринимаемого посредством одномерного скольжения по ДНК. Хотя большая склонность к скольжению может повысить эффективность поиска, можно отметить, что N-хвост также может снизить коэффициент диффузии.Более того, хвост может облегчить перенос между сегментами, который, как известно, ускоряет поиск специфического сайта-мишени на ДНК (31–34).

Схематическое изображение влияния неупорядоченного хвоста на поиск ДНК. Неупорядоченный хвост (красный) глобулярного белка (синий) можно рассматривать как еще один субдомен, который неспецифически взаимодействует с ДНК. Неупорядоченный хвост может способствовать динамике скольжения и увеличивать сродство к ДНК, когда он взаимодействует с соседним сегментом ДНК.Альтернативно, хвост может способствовать динамике брахиации межсегментного переноса (также называемого механизмом обезьяньего стержня), при котором белок прыгает между удаленными областями ДНК через промежуточное соединение, в котором хвост и свернутые части временно связаны с разными сегментами ДНК.

Межсегментный перенос хвостовых ДНК-связывающих белков между различными участками ДНК достигается разделением белка на два фрагмента (29): структурированный фрагмент и неупорядоченный хвост. Эта конструкция поддерживает механизм «обезьяньего стержня» или «брахиации», при котором белок перескакивает между двумя молекулами ДНК через промежуточное соединение, в котором спираль узнавания белка адсорбируется на одном фрагменте ДНК, а неупорядоченный N-хвост адсорбируется на другом. , используя движение, напоминающее движение ребенка, плывущего по перекладине для обезьян (18).Альтернативно, перенос может быть описан как следование механизму заброса мух (35–38), в котором неупорядоченный хвост достигает областей ДНК за пределами непосредственной близости от местоположения структурированного фрагмента белка. В мультидоменных факторах транскрипции неупорядоченный линкер, который соединяет два свернутых домена, играет аналогичную роль в облегчении динамики брахиации (34, 39).

Для того, чтобы неупорядоченный хвост способствовал событиям межсегментного переноса, он должен обладать определенными характеристиками.Гомеодомены HoxD9, Antennapedia (Antp) и NK-2 Drosophila ищут ДНК совершенно по-разному, хотя они имеют очень похожие структурированные области. Наличие N-хвоста в этих гомеодоменах модулирует свойства поиска ДНК. Эти хвосты имеют разную длину (9, 10 и 17 остатков соответственно) и имеют разные чистые заряды (+2, +4 и +5 соответственно). Можно сделать вывод, что эффективность динамики обезьяньего стержня будет коррелировать с длиной хвоста и его положительным чистым зарядом.Однако очевидно, что связь между последовательностью хвоста и эффективностью поиска более сложная, чем это. Например, большинство заряженных остатков этих трех N-хвостов сгруппированы вместе, и можно предположить, что эта кластеризация служит для образования эффективной единицы концентрированного заряда, необходимой для прыжка (18). Предыдущие работы Karlin et al. Проанализировали закономерности в последовательностях белков и показали, что заряженные остатки имеют статистически значимую тенденцию группироваться вместе либо в последовательности с чередованием знаков, либо в виде коротких последовательных последовательностей остатков одного знака (40, 41).

В этом вычислительном исследовании мы исследуем динамику сотен специально сконструированных N-хвостов гомеодоменов NK-2 и Antp (566- и 55-хвостовые варианты соответственно) на ДНК, чтобы расшифровать взаимодействие между характеристиками последовательностей неупорядоченные хвосты и характер их взаимодействия с неспецифической ДНК. В частности, мы спрашиваем, как чистый заряд хвоста и организация зарядов вдоль хвоста влияют на эффективность поиска. Наконец, мы спрашиваем, найдены ли биофизические критерии, которые необходимы для содействия межсегментному переносу, в статистическом анализе природных ДНК-связывающих белков.

Результаты и обсуждение

Влияние чистого заряда неупорядоченного хвоста на поиск ДНК.

Неупорядоченные области в белках, и особенно неупорядоченные хвосты ДНК-связывающих белков, богаты положительно заряженными остатками (10, 11). Низкая сложность последовательности неупорядоченных белков отражается не только в их составе последовательности (т.е.изобилии некоторых остатков), но также в характере и периодичности повторяемости последовательностей (11, 42). Например, около 40% N-хвостов гомеодоменов NK-2 и Antp дикого типа содержат положительно заряженные остатки (эти хвосты включают шесть и четыре положительно заряженных остатка и ноль и один отрицательно заряженный остаток, соответственно).Кроме того, заряды сгруппированы: все шесть положительно заряженных остатков в хвосте NK-2 последовательно связаны с образованием высокозарядного сегмента, а для Antp три из четырех положительно заряженных остатков в его хвосте образуют заряженный сегмент (Таблица S1 ). Эти положительные заряды необходимы для того, чтобы ДНК-связывающие белки могли взаимодействовать с ДНК. Однако влияние количества последовательных зарядов на сегмент и положения зарядов вдоль хвоста на поиск ДНК неизвестно.

Для решения этих проблем мы разработали 153 и 55 вариантов N-хвостов гомеодоменов NK-2 и Antp соответственно. Эти варианты различаются длиной положительно заряженного сегмента (сегменты 1–17 или 1–10 положительных зарядов для NK-2 и Antp соответственно) и положением сегментов вдоль хвоста (см. Рис. 2). Влияние длины и положения заряженного сегмента на неспецифические взаимодействия гомеодомена с ДНК изучали путем моделирования динамики каждого варианта на двух параллельных молекулах ДНК размером 100 п.н. (разделенных на 60 Å) в широком диапазоне концентраций солей с использованием простая вычислительная модель (18, 39, 43), в которой взаимодействия белок-ДНК были представлены исключительно электростатическими силами.Мы обнаружили, что концентрация соли для оптимально эффективного поиска составляла 0,07 M для большинства вариантов NK-2 и 0,08 M ​​для большинства вариантов Antp.

Доли скользящего, скачкообразного и трехмерного поиска, выполняемые 153 вариантами гомеодомена NK-2 с разными последовательными длинами сегментов положительного остатка и положениями на N-хвосте, показаны на рис. 2 A — C . Цвета диаграмм разброса представляют процент использования соответствующего режима поиска.Короткие положительно заряженные сегменты широко используются в режиме трехмерного поиска, независимо от их положения вдоль N-хвоста, в то время как хвосты, которые сильно заряжены, больше используют режим прыжка при поиске ДНК. В режиме скользящего поиска широко используются варианты с умеренно заряженными сегментами (с 5–9 зарядами), расположенными ближе к N-концу их хвостов.

Сильная зависимость использования режимов скачкообразного и скользящего поиска от эффективного заряда N-хвоста означает, что на коэффициент одномерной диффузии, D ₁ , также влияют заряды хвоста.Значение D ₁ для 153 вариантов NK-2, когда они линейно диффундируют по одной молекуле ДНК длиной 100 п.н. при концентрации соли 0,01 M (за счет динамики скольжения или прыжка), увеличивается с уменьшением эффективного заряда (рис. S1). ), потому что количество прыжков увеличивается за счет скольжения при этой концентрации соли, причем прыжки происходят быстрее, чем спиральное скольжение вдоль основной цепи ДНК (43). Действительно, многие варианты хвоста, которые выполняют больше прыжков, чем скольжение, имеют большие значения D ₁ .Тем не менее, мы обнаружили, что скорость линейной диффузии медленнее для хвостов с заряженным сегментом средней длины, чем для длинных заряженных сегментов, предположительно из-за перекрестных помех между хвостом и глобулярной частью гомеодомена, которые влияют на его взаимодействие с основной частью гомеодомена. канавка и, следовательно, линейная диффузия. В целом, не только чистый заряд хвоста, но и положение зарядов вдоль хвоста может влиять на движение белка в ДНК.

Высокая плотность положительного заряда на хвосте может ускорить межсегментный перенос, поскольку он может действовать как дополнительный сильный мотив распознавания ДНК.С другой стороны, высокоположительный сегмент может увеличивать сродство белка к ДНК и, таким образом, ингибировать межсегментный перенос, как показал термодинамический анализ (19, 27). На рис. 2 D показано количество переходов между сегментами, выполненных 153 вариантами НК-2. Короткого заряженного сегмента недостаточно для передачи от одной молекулы ДНК к другой из-за его слабого притяжения к ДНК. Хвост с сильно заряженным сегментом имеет очень высокое сродство к неспецифическим взаимодействиям с ДНК, что не поддерживает прыжки.Хвосты, которые состоят из умеренно заряженного сегмента, расположенного ближе к N-концу, имеют умеренное сродство к ДНК, что позволяет им взаимодействовать с ДНК, а также исследовать альтернативные участки ДНК, и, действительно, достигается наибольшее количество событий межсегментного переноса. для вариантов с умеренно длинным заряженным сегментом, расположенным ближе к N-концу (NK-2: Рис. 2 D ; Antp: Рис. S2). Хотя неупорядоченные N-хвосты дикого типа могут быть более сложными, чем моделируемые хвосты 153, мы отмечаем, что неупорядоченные N-хвосты гомеодоменов NK-2 и Antp дикого типа имеют зарядовую структуру, которая напоминает спроектированные варианты, которые выполняют наибольшие числа межсегментных трансферов.Например, хвост NK-2 дикого типа включает аспарагиновую кислоту в положении # 3, а Antp дикого типа имеет остаток глицина (который разбивает сегмент из четырех положительно заряженных остатков на сегменты, содержащие три и один остаток). Тем не менее, хвосты дикого типа включают сегмент средней длины, который поддерживает усиленный межсегментный перенос.

Прямой перенос от одного фрагмента ДНК к другому значительно повышает эффективность поиска мишеней ДНК-связывающим белком (18, 31). Здесь мы исследовали эффективность поиска ДНК по 153 вариантам NK-2.Эффективность поиска оценивается по количеству позиций ДНК, исследованных во время моделирования гомеодоменом с использованием скольжения (подробнее см. Ссылку 43). Оптимальная эффективность поиска достигается при наличии умеренного эффективного заряда, расположенного ближе к N-концу вариантного хвоста (рис. S3). Такая высокая эффективность поиска связана с большим количеством событий межсегментного перехода, наблюдаемого для этих вариантов NK-2, однако корреляция между эффективностью поиска и количеством переходов не является линейной (рис.S3). Варианты с относительно коротким заряженным сегментом в их хвосте (группа I) ищут ДНК более эффективно, чем другие варианты, хотя они не участвуют во многих событиях межсегментного переноса. Варианты с более высоко заряженным сегментом (группа II) имеют тенденцию к поиску ДНК с меньшей эффективностью, хотя они больше используют механизм брахиации и выполняют больше событий межсегментного переноса (Fig. S3). Варианты группы I, которые имеют более короткие заряженные сегменты, чем в группе II, имеют ограниченную способность выполнять межсегментный перенос, потому что хвост (который необходим для брахиации) имеет слабое сродство к ДНК, но они все еще могут эффективно искать из-за своего эффективная линейная диффузия на одиночной молекуле ДНК.Это наблюдение показывает, что заряженная часть хвоста является важным компонентом процесса поиска, который может влиять на качество поиска с помощью нескольких механизмов.

Влияние распределения заряда вдоль неупорядоченного хвоста на поиск ДНК.

Мы обнаружили, что неупорядоченный N-хвост эффективно влияет на брахиацию между разными участками ДНК, если кластер зарядов имеет среднюю длину (т.е. 4-7 зарядов) и расположен ближе к N-концу. Тем не менее, неясно, как сегментация кластера положительных зарядов на более мелкие группы повлияет на способность гомеодомена к брахиации и, следовательно, к эффективному поиску ДНК.Чтобы ответить на эти вопросы, мы разработали варианты неупорядоченного хвоста гомеодомена NK-2, в котором шесть положительно заряженных остатков были распределены по разным образцам вдоль хвоста. Существует десять возможных способов сегментирования шести зарядов (см. , методы и рис. 3), и каждый шаблон сегментации может быть дополнительно изменен путем введения промежутков различной длины между сегментами. Среди всех возможностей мы отобрали 253 варианта и исследовали, как степень сегментации и интервал влияет на количество выполненных событий межсегментного переноса.

Влияние сегментации зарядов и интервалов на поиск ДНК. Количественные характеристики межсегментного переноса вариантами NK-2 между двумя молекулами ДНК, разделенными на 60 Å при концентрации соли 0,07 М. Все варианты N-хвоста включают шесть положительных зарядов, которые разделены на разные зарядовые сегменты и расположены в разных местах вдоль хвоста. . Существует ( A и B ) 253 варианта, которые включают только шесть положительных зарядов и ( C и D ) еще 160 вариантов, которые включают фиксированный отрицательный заряд в позиции третьего остатка.Графическое изображение иллюстрирует конструкцию вариантов с отрицательным зарядом и без него. Все варианты классифицируются на основе их индексов сегментации зарядов ( C _indx ), расстояния ( S _indx ) и среднего положения зарядов вдоль хвоста (〈 r 〉). Цвет в целом представляет количество событий пересечения сегментов. Некоторые модели сегментации сборов проиллюстрированы в B . Например, образец (+1) × 6 соответствует хвостам с шестью заряженными сегментами (распределенными вдоль хвоста с различным расположением), каждый из которых представляет собой один положительно заряженный остаток, а образец (+6) соответствует одному заряженному сегменту из шести последовательные остатки (которые расположены в разных местах вдоль хвоста).Обратите внимание, что некоторые варианты могут иметь одинаковые значения C _indx и 〈 r 〉, но разные значения S _indx (или одинаковые значения C _indx и S _indx , но разные значения 〈 r 〉). Эти варианты будут перекрываться, и в этих случаях будут показаны варианты с наибольшим количеством событий пересечения сегментов. Серые кружки обозначают C _indx , 〈 r 〉 и S _indx N-хвоста NK-2 дикого типа.

Фиг. 3 показывает количество событий межсегментного переноса, выполняемых 253 вариантами NK-2, имеющими хвосты, состоящие из шести положительно заряженных остатков. Когда шесть положительных зарядов более сгруппированы (т. Е. Менее сегментированы, более высокие значения C _indx ) и их среднее положение ближе к середине или N-концу хвоста, то белок прыгает чаще (рис. 3 А ). Этот результат означает, что по мере того, как длина промежутков, образованных промежуточными нейтральными остатками, становится короче, а общее количество промежутков уменьшается (т.е., более низкие значения S _indx ), количество межсегментных перемещений увеличивается (Рис. 3 B и Рис. S4).

Чтобы изучить, как присутствие отрицательно заряженных остатков влияет на способность гомеодомена переходить от одной молекулы ДНК к другой, мы ввели отрицательно заряженную бусинку в хвост в положении 3, который занят Glu в молекулах дикого типа. хвост гомеодомена НК-2. Было разработано 160 дополнительных вариантов с шестью положительными зарядами, размещенными в различных схемах сегментации и разнесения в присутствии отрицательного заряда.Эти варианты демонстрируют поведение прыжка, подобное наблюдаемому для вариантов без отрицательного заряда (рис. 3 C и D ), но геометрические варианты расположения положительных зарядов ограничены наличием отрицательного заряда. Соответственно, больше скачков наблюдается, когда положительные заряды более сгруппированы, то есть когда между положительными зарядами меньше и / или меньше промежутков. Интересно отметить, что NK-2 дикого типа, обведенный кружком на диаграммах рассеяния на рис.3, выполняет наибольшее количество межсегментных переносов, предполагая, что расположение заряженных остатков в естественном хвосте ДНК-связывающих белков поддерживает эффективное сканирование ДНК по механизму брахиации / обезьяньего стержня.

Наш результат о том, что эффективный заряд N-хвостов значительно влияет на их склонность к скольжению, а также способность N-хвоста стимулировать прыжки через механизм обезьяньего стержня, дополняется результатами недавних исследований Марша и Форман-Кея (15 ) и Мао и др.(16). Эти исследования показали для 32 и 21 внутренне неупорядоченных белков соответственно, что их чистый заряд определяет степень их уплотнения и структуру. В этих двух экспериментальных исследованиях точный анализ особенностей последовательности был непрактичным из-за ограниченного набора белков. Хотя эти исследования показывают, что уплотнение внутренне неупорядоченных белков линейно зависит от суммарного заряда их хвостов, мы показываем, что функция, выполняемая этими белками (то есть способность N-хвоста перемещаться между молекулами ДНК), не постоянно увеличиваются с увеличением чистой платы, и можно искать чистую плату, при которой функция оптимизируется.Кроме того, наше исследование предполагает, что, помимо чистого заряда, организация зарядов и их распределение вдоль хвоста могут довольно существенно модулировать поиск ДНК. Соответственно, не только количество положительных зарядов, но также их расположение, степень сегментации, а также количество и длина промежутков между ними могут существенно повлиять на функционирование хвоста.

Биоинформатика сегментации заряда в неупорядоченном хвосте ДНК-связывающих белков.

Наше наблюдение о том, что особенности N-хвостов гомеодоменов NK-2 и Antp дикого типа коррелируют с большим количеством событий межсегментного переноса, может предполагать, что хвосты ДНК-связывающих белков выбраны так, чтобы иметь структуру заряда, совместимую с эффективным ДНК-поиск.Чтобы исследовать этот аспект более тщательно, мы проанализировали последовательность неупорядоченных N-хвостов 1384 факторов транскрипции гомеодомена. Суммарный заряд N-хвостов положительный, а их положительные заряды расположены более плотно, чем их отрицательные заряды, и чем положительные заряды в глобулярных частях гомеодоменов (рис. 4 A и B ). Максимальная длина сегмента для положительных зарядов в N-хвосте составляет 0–6 остатков, а для отрицательных зарядов максимальная длина составляет 0–2 остатка.В глобулярной части гомеодоменов разница между распределениями отрицательно и положительно заряженных сегментов намного меньше (рис. 4 C и D ). Расстояние между заряженными кластерами в хвосте меньше, чем в шаровых областях гомеодомена (рис. S5).

Биоинформатический анализ структуры заряда на N-хвостах гомеодоменов. Распределение ( A и B ) эффективных положительных (синий) и отрицательных (красный) зарядов и ( C и D ) максимальных абсолютных заряженных сегментов в неупорядоченных N-хвостах и ​​глобулярных частях 1384 дикого типа гомеодоменные ДНК-связывающие белки.

Заключение

Ранее мы показали, что ДНК-связывающие белки имеют тенденцию иметь неупорядоченные хвосты, которые, функционируя как другой субдомен, участвуют в неспецифических взаимодействиях с ДНК в результате их часто положительного заряда. Неупорядоченный хвост может как увеличивать сродство глобулярной области к ДНК, так и способствовать межсегментному переносу от одной молекулы ДНК к другой, поскольку он поддерживает брахиаторное движение белка. Большее количество прыжков приведет к более эффективному поиску ДНК.Способность неупорядоченного хвоста способствовать прыжку зависит от его длины и заряда сети (18). Тем не менее, очевидно, что детали последовательности хвоста определяют его природу и его взаимодействие с ДНК.

В этой статье мы сообщаем о обширном вычислительном исследовании, направленном на анализ связи между характеристиками последовательности хвоста и эффективностью поиска ДНК белками. Мы сконструировали 566 вариантов хвоста из 17 остатков гомеодомена NK-2 и 55 вариантов хвоста Antp из 10 остатков.Варианты различались количеством положительных остатков в хвосте, их положением вдоль хвоста, сегментацией зарядов, а также количеством и длиной промежутков между ними, образованных присутствием промежуточных нейтральных и отрицательных остатков. Мы изучили динамику каждого варианта, поскольку он неспецифически взаимодействовал с двумя параллельными молекулами ДНК длиной 100 п.н. (т.е. там, где взаимодействия управлялись только электростатическими силами). Мы обнаружили, что большее количество межсегментных перемещений достигается, когда хвост значительно, но умеренно заряжен (т.е., 6–10 заряженных остатков для хвостов NK-2) и когда заряды сосредоточены в середине хвоста или ближе к его N-концу. Повышенная кластеризация зарядов, то есть отсутствие больших или многочисленных пространств между заряженными остатками, усиливает механизм обезьяньего стержня.

Естественные хвосты ДНК-связывающих белков могут также включать отрицательно заряженные остатки, хотя общий заряд положительный. Поэтому мы разработали набор хвостов, в которых положительные заряды были расположены в различных положениях, в то время как третье положение было занято отрицательным остатком, как в N-хвосте гомеодомена NK-2 дикого типа.Эти варианты ведут себя аналогично вариантам, в которых отсутствует отрицательный заряд, хотя наличие отрицательного заряда означает, что для достижения улучшенного механизма прыжка требуется более высокий эффективный положительный заряд. Очевидно, что последовательность в хвостах ДНК-связывающих белков дикого типа может быть более сложной и включать больше отрицательных зарядов, расположение которых вдоль хвостов может влиять на взаимодействие с ДНК. Возможно, что в таких случаях организация положительных зарядов будет отличаться от той, о которой сообщалось на основе наших простых разработанных хвостов.

Интересно, что мы обнаружили, что паттерн заряда N-хвоста гомеодоменов NK-2 и Antp дикого типа согласуется с большим количеством событий межсегментного переноса. Поэтому есть соблазн предположить, что естественные хвосты эволюционно отбираются для достижения эффективного поиска ДНК. Чтобы более тщательно изучить эволюционный отбор неупорядоченного хвоста ДНК-связывающих белков, мы проанализировали структуру заряда N-хвоста 1384 гомеодоменов. Мы обнаружили, что N-хвосты сильно заряжены положительно, их положительные заряды сильно сгруппированы, а расстояние между кластерами зарядов намного меньше, чем между кластерами положительных зарядов в структурированных областях гомеодоменов.В целом, наши результаты подтверждают недавние сообщения (9, 10) о том, что последовательности внутренне неупорядоченных областей обладают уникальными характеристиками, которые регулируют их структуру и функцию, и предполагают, что хвосты ДНК-связывающих белков были эволюционно выбраны так, чтобы иметь структуру заряда для оптимальной ДНК. поиск.

Методы

Имитационная модель.

Молекулярная и динамическая природа поиска ДНК вариантами гомеодоменов NK-2 и Antp была изучена с использованием сокращенной модели (18, 43), которая позволяет производить выборку процессов в долгосрочном масштабе, таких как скольжение, прыжки, трехмерная диффузия, и межсегментный перенос (44–46).Мы смоделировали ДНК как имеющую три шарика на нуклеотид, представляющие фосфат, сахар и основание. Каждая бусина была расположена в геометрическом центре группы, которую она представляет, а бусинкам, представляющим фосфатные группы ДНК, приписывался отрицательный точечный заряд.

При моделировании молекула B-ДНК размером 100 п.н. использовалась для изучения диффузии белка на одной двухцепочечной молекуле ДНК, а две параллельные молекулы B-ДНК по 100 п.н. были использованы для исследования динамики межсегментного переноса. Белок и ДНК помещали в коробку размером 300 × 300 × 700 Å , причем ДНК помещали в центр коробки вдоль ее оси Z.Две молекулы ДНК были разделены на 60 Å, поскольку на этом расстоянии наблюдалось наибольшее количество скачков гомеодоменов (18). ДНК оставалась на месте и была жесткой на протяжении всего моделирования.

Белок был представлен одной бусинкой для каждого остатка, расположенного на Cα этого остатка. В модель загружали шарики, представляющие заряженные аминокислоты (Lys, Arg, Asp и Glu). В отличие от ДНК, белок оставался гибким во время моделирования и мог подвергаться событиям сворачивания и разворачивания.Мы смоделировали белок с помощью модели на основе нативной топологии, соответствующей идеально организованному энергетическому ландшафту (47), где взаимодействия нативных белков были привлекательными, а все другие взаимодействия были отталкивающими (48). В дополнение к естественным взаимодействиям были включены электростатические взаимодействия между всеми заряженными остатками белка и фосфатной бусиной ДНК, которые моделировались потенциалом Дебая-Хюккеля, который учитывает ионную силу растворенного вещества, погруженного в водный раствор (43 ).Динамику каждого белка изучали при концентрациях соли в диапазоне 0,01–0,12 М, используя диэлектрическую проницаемость 80 и температуру, при которой белок полностью свернут. Это исследование показало, что концентрация соли для оптимальной эффективности поиска составляет 0,07 M для NK-2 и 0,08 M ​​для гомеодоменов Antp (аналогичные оптимальные концентрации соли были получены для вариантов этих белков, в которых мутировали только хвосты). Мы подчеркиваем, что информация из кристаллической структуры использовалась только для моделирования белка, в то время как интерфейс между белком и ДНК моделировался исключительно электростатическими и отталкивающими взаимодействиями.Соответственно, наша модель не включает никакого предубеждения в отношении специфического режима связывания. Более подробную информацию о моделировании можно найти в ссылках. 18, 39, 43, 49.

Используя эту модель, мы изучили взаимодействие и структуру нескольких ДНК-связывающих белков с неспецифической ДНК (18, 39, 43). Неспецифические взаимодействия между белком и ДНК оценивались количественно, классифицируя каждый снимок как выполняющий одномерную диффузию (скользящую или скачкообразную) или трехмерную диффузию. Траектории были проанализированы для количественной оценки процента скольжения и прыжков белка, структурных особенностей во время скольжения, количества событий межсегментного переноса и коэффициента линейной диффузии ( D ₁ ), как описано в ссылке.43.

Разработанные варианты гомеодоменных белков.

Были сконструированы сотни вариантов гомеодоменов NK-2 и Antp (идентификаторы PDB для белков дикого типа — 1NK2 и 1AHD соответственно). Эти варианты отличались друг от друга только с точки зрения зарядовых свойств их N-хвостов и были созданы с целью расшифровать, как детали последовательности хвоста могут модулировать поиск ДНК по гомеодоменам. Варианты были разработаны для ответа на два основных вопроса.Первый вопрос заключается в том, как количество зарядов на хвосте (то есть суммарный заряд) и их расположение вдоль хвоста влияют на количество прыжков гомеодомена с одной молекулы ДНК на другую. Чтобы ответить на этот вопрос, мы разработали 153 варианта хвоста NK-2 из 17 остатков, в котором один кластер, состоящий из 1-17 последовательных положительных зарядов, расположен в различных положениях вдоль хвоста. Для гомеодомена Antp, хвост которого состоит из 10 остатков, также были сконструированы 55 вариантов с различными последовательными длинами кластеров положительных остатков и положениями на N-хвосте.Второе свойство последовательности хвоста, которое может влиять на прыжки, — это распределение зарядов вдоль хвоста. Чтобы устранить взаимосвязь между степенью сегментации зарядов и поиском ДНК, были разработаны еще 160 вариантов NK-2. Все эти варианты включали шесть положительных зарядов, сегментированных по разному образцу и разделенных разным количеством промежутков разной длины.

Поскольку N-хвост гомеодомена NK-2 дикого типа включает отрицательно заряженный остаток в положении 3, мы разработали третий набор из 253 вариантов N-хвоста NK-2.В этих вариантах шесть положительных зарядов располагались по-разному вдоль хвоста, варьируя количество зарядов на заряженный сегмент, а также количество и длину промежутков между сегментами. Во всех случаях отрицательный заряд помещался в третью позицию хвоста. Этот набор вариантов аналогичен второму набору из 160 вариантов, за исключением того, что один фиксированный отрицательный заряд помещается в третью позицию.

Количественная характеристика событий межсегментного переноса для хвостовых вариантов.

Варианты хвоста были классифицированы по следующим параметрам, чтобы уловить сложность последовательности распределения зарядов вдоль неупорядоченного хвоста.

1. Эффективный положительный заряд, рассчитывается как Np / L , где Np — общее количество заряженных остатков в N-хвосте, а L — длина хвоста в аминокислотах

2. Среднее положение зарядов на хвосте 〈 r 〉, рассчитанное как Σ r _i / Np × L , где r _i — положение заряженного остатка и вдоль хвоста.Значения 〈 r 〉 варьируются от 0–1, где значение нуля указывает, что положительные заряды расположены на N-конце, тогда как значение 1 указывает, что они расположены на C-конце.

3. Индекс сегментации положительного заряда, C _indx , рассчитывается как, где N _i — количество положительных зарядов в сегменте i . Можно сделать десять различных схем сегментации шести зарядов N-хвоста НК-2.Значения C _indx , которые близки к единице, указывают на меньшую сегментацию, а значения, близкие к 0, указывают на обширную сегментацию. Ниже приведены десять возможных шаблонов сегментации и соответствующие им значения C _indx : ([+1 × 6], C _indx = 0,17), ([+2 × 2, +1 × 2], C _indx = 0,28), ([+2 × 3], C _indx = 0,33), ([+ 3, +1 × 3], C _indx = 0,33), ( [+3, +2, +1], C _indx = 0.39), ([+3 × 2], C _indx = 0,5), ([+4, +1 × 2], C _indx = 0,5), ([+4, +2] , C _indx = 0,55), ([+5, +1], C _indx = 0,72), ([+6], C _indx = 1,0). Есть много других альтернативных формул для количественной оценки степени сегментации заряда. Мы выбрали текущую формулу, потому что она проста и ее значения более равномерно варьируются от 0 до 1.

4. Индекс расстояния S _insx описывает расстояние между положительно заряженными сегментами., где S ^eff — нормализованное количество пробелов в хвосте (т. е. S ^eff = S / L , где S — общее количество пробелов в хвосте) и S _i — количество пробелов в сегменте i . Считается, что остаток функционирует как «пространство» между положительными зарядами, если он отрицательно заряжен или нейтрален. Для вариантов с одним кластером положительных зарядов (т.е., без пробелов) S _indx установлен на ноль, тогда как значение S _indx , близкое к нулю, указывает на наличие большого количества коротких промежутков между положительными зарядами, значение, приближающееся к единице, указывает на наличие несколько длинных пространств. Обратите внимание, что S _indx получает более низкие значения либо из-за небольшого количества пробелов (низкое S ^eff ), либо из-за высокой степени сегментации (есть много пробелов, но каждое пространство S _i мало ).

Статистический анализ свойств хвоста ДНК-связывающих белков.

Последовательности гомеодоменных белков были загружены с сайта NHGRI http://genome.nhgri.nih.gov/homeodomain/ (50). Определение белковых хвостов проводили с помощью IUPred (51). Считалось, что белок имеет неупорядоченный хвост, если неструктурированный сегмент, по крайней мере, из пяти аминокислот предсказывался либо на его N-конце, либо на его С-конце (если предсказывалось, что белок будет иметь неструктурированные сегменты на обоих концах, два хвоста учитывались отдельно) .Глобулярную область гомеодомена определяли путем исключения неупорядоченного хвоста из всей последовательности белка. Заряд на хвосте рассчитывали путем присвоения одного положительного заряда (+1) каждому Lys или Arg в хвосте и одного отрицательного заряда (-1) каждому Glu или Asp. Гистограммы эффективного заряда, максимальных заряженных сегментов, длины последовательности, эффективных пространств и положения заряда были получены из проанализированных данных.

Благодарности

Мы благодарны Ариэлю Азиа за плодотворные обсуждения по биоинформатическому анализу.Эта работа была поддержана Центром макромолекулярных сборок Киммельмана и Фондом Минерва при финансовой поддержке Федерального министерства образования и исследований Германии. Ю.Л. занимает должность председателя совета директоров по развитию карьеры Лилиан и Джорджа Литтлов.

Сноски

• Автор: Д.В. и Ю.Л. спланированное исследование; Д.В. и Ю.Л. проведенное исследование; Д.В. и Ю.Л. проанализированные данные; и Д.