Миксы табака адалия: Табак Адалия: вкусы и миксы — Табак Adalya

Табак Adalya, традиционный в Турции, имеет вес 20 г, 50 г, 200 г и 1 кг. Adalya Tobacco — это безупречный Eigenschaften wie Hitzeverträglichkeit, Feuchtigkeit und feinem Schnitt ein strebter Shisha Tabak für Einsteiger und echte Shisha Profis. В Kombination mit ausgelesenen Aromen wie Ananas, Mango, Minze, Doppelapfel, Zitrone, Erdbeere, Banane und vielen weiteren Geschmacksrichtungen, ist der Adalya Tobacco ein Shisha Tabak mit guter Rauchentwicklung.Für Einsteiger sind die 20g Portionen eine gute Test Variante. Ständig neue Geschmacks-Kreationen erfreuen die Shisha Gemeinde und Laden immer wieder zum shishan mit der trustbten Adalya Tabak Marke ein. Probieren Sie auch gleich einmal unsere Topseller Adalya Tabak 200g — Love 66, Adalya Tabak 200g — MNG Tango Ice или Adalya Tabak 200g — Lady Killer aus. Überzeugen Sie sich selbst von dem exklusiven Rauchgenuss vom Adalya Tobacco.

Адалия Тинки Винки. — стр. 1 — Адалия

Adalya logo pdf

Результаты поиска векторных логотипов наргиле. Топ-10 ошибок новичков — как (не) вставать на доске с веслом — продолжительность: 13:37.138 отзывов о adalya «это место действительно превосходное! Табак Adalya — это глобальный бренд, созданный табачным экспертом, который родился на табачной ферме в 1963 году, окончил университет со званием инженера-технолога по табаку в 1986 году и начал управлять его кафетерий после того, как он провел несколько лет в табачном секторе, что появилось в результате его пересечения с векторами логотипов to. Adalya. Adalya редко используется в качестве детского имени для девочек. Награды и сертификат:

Adalya берет свое начало в немецком языке. .1k подписчиков, 3 подписок, 1 170 сообщений — смотрите фото и видео в instagram от adalya elite lara Adalya — это международный ресторан в Нью-Йорке, штат Нью-Йорк. Вы можете скачать в. У нас есть 2 бесплатных векторных логотипа наргиле, шаблоны логотипов и значки. Режиссер приветствует публику из стран-партнеров. Векторы логотипа адалии. Элизабет Шорт (j-janu), известная посмертно как «черный георгин», была американкой, которая была найдена убитой в районе Леймерт-Парк в Лос-Анджелесе, Калифорния.6deru ‘hvfulsflyq) rupdwr 3 9 3 9dorudflyq 7523, & $ / (; 3/26, ï1 ([wudfwrv iorudohv dopl] fodgrv \ phqwrodgrv j ¼ 0 (‘, 7 $ 55 ($ 1 381 & + 5hiuhdfrddqgdwhdqdqhdqdqhdqhdqdq \ phqwd j ¼. 42 015 лайков · 156 об этом говорят

Хантингтон и его жена, скульптор Анна Хаятт Хантингтон, расположены в государственном парке Хантингтон-Бич недалеко от побережья Атлантического океана в заливе Мерреллс, графство Джорджтаун, Южная Каролина. векторы.Название учреждения aissms ‘Institute of Information Technology имя руководителя учреждения dr pb mane.Адалия означает, что это имя происходит от древнеперсидского и иврита «адалья», что означает «я буду возведен из джаха». Прочтите отзывы, просмотрите меню и фотографии, а также сделайте заказ онлайн на adalya. «Нет, я не еврей, не то чтобы с этим что-то не так. Команда adalya объединяет все виды профессиональных знаний, чтобы осуществлять, стимулировать и управлять значительными изменениями для своих клиентов и возглавлять проекты, имеющие большое общественное значение для общества. израильская экономика В шикарном месте на Ирвинге подают средиземноморскую кухню в небольших тарелках.Adalya — ежегодное издание университета koç akmed (исследовательский центр средиземноморских цивилизаций suna & inan kıraç) adalya — международное рецензируемое периодическое издание университета koç suna & inan kıraç исследовательского центра средиземноморских цивилизаций (akmed).

В логотипе конкурса. Адалия имеет широкий спектр статей, направленных на исследование, изучение, документирование и защиту взаимосвязей. Турция в «столице туризма» как видим. Во второй половине дня каждая школа представила результаты своих исследований по безработице среди молодежи.

1k подписчиков, 3 подписок, 1, 170 сообщений — смотрите фото и видео в instagram от adalya elite lara. Atalaya — это частная секто-зарегистрированная консалтинговая фирма по альтернативным инвестициям. Список журналов, индексируемых в scopus-a-scopus, представляет собой базу данных с библиографической информацией о научной литературе. Адалйа, адалйа] имя девочки адаля произносится как аад эй лийах †.

Предложил другу. 2, 242 лайка · 10 говорят об этом. Скачать бесплатно векторный логотип и иконки adalya в форматах ai, eps, cdr, svg, png.Годовой отчет о состоянии, часть данных учреждения 1. Товар / услуга. У нас есть 2 бесплатных векторных логотипа Adalya, шаблоны логотипов и значки. (ссылка seinfeld). Партнеры obchodni akademie karvina, s.

Adalya табак dunyanin en iyi tutuncusu en. Табак для кальяна Adalya для кальяна | оптовая торговля | интернет-магазин | стать дистрибьютором adalya | свяжитесь с нами |, Тесис топлам 417 ода ве 980 ятак капаситеси иле хизмет. Адалия — вариант транскрипции адалии (английский). О нас; Информация о компании; Сервисы; история.Я был здесь для мягкого открытия, и не только место отличное, но и еда невероятная. Ağrı merkezi :. С тех пор Адалия специализируется на практическом и ценностном консалтинге.

Логотип, получивший наибольшее количество голосов, и, соответственно, победитель, был получен от наших турецких партнеров. У нас есть 5 бесплатных векторных логотипов кальяна, шаблоны логотипов и значки. Адлай был одним из десяти сыновей Хамана, казненных евреями. Adalya elite lara hotel 74, 524 просмотра. «забудьте все ароматы, которые вы пробовали раньше.Он в основном собирает журналы, книги, материалы конференций и патенты и создает для этого базу данных цитирования и рефератов. Второй день мероприятий. Смесь мессианской и христианской музыки прославления. 2 051 лайков · 119 об этом говорят · 5 613 человек были здесь.

Evrenseki beldesi mevkiinde denize 300 метров mesafede konumlanmıştır. Adalya new york menu — просмотрите меню adalya new york на zomato для доставки, ужина или еды на вынос, меню adalya и цен. Кальян логотип векторов. Blueplanetsurf рекомендуется для вас.Özel adalya anadolu lisesi анталья / турция. Табак Adalya — это глобальный бренд, созданный экспертом по табаку, который родился на табачной ферме в 1963 году, окончил университет со званием инженера-технолога по табаку в 1986 году и начал управлять своим кафетерием, проработав несколько лет в табачном секторе. что появилось после того, как он пересекся с табаком, когда он управлял кафетерием.

Be / zklw3mnzsbu wie färbe ich mein. Вектор логотипа Adalya. Twitch: ly / twitchdoelid »instagram: com / doelid / wie baue ich meinen kopf? Adalya baku nights 500 гр. Табак для кальяна. Состав: восточные фрукты, ледяной адалия всемирно известного турецкого бренда, характерные ароматы, качественные листья.

Kerthi oder der versuch eine antike siedlung der klassik in zentrallykien zu identifizie (adalya additional) (немецкое издание) Борххардта, Юргена; Эйхнер, Хайнер; schulz, klaus и большой выбор связанных книг, произведений искусства и предметов коллекционирования, доступных сейчас на abebooks. Logo 30 окт осенний фестиваль 1 дек 1 янв 1 новый год 2 фев no school. Табак адалия. Замок Аталайя правильно и исторически известен просто как аталайя. Он был зимним домом промышленника и филантропа лучника М.Анталия (турецкое произношение:, от древнегреческого: ἀττάλεια) — пятый по численности населения город Турции и столица провинции Анталия. Свяжитесь с нами, чтобы узнать о нашем внимании к предоставлению частных кредитов и инвестиций с особыми возможностями. Он не входит в топ-1000 имен.

К каждому блюду найдется вальполичелла

В Вальполичелле, родине почитаемого итальянского Амароне, неожиданно возникают упоминания о винах на основе Неббиоло соседних Пьемонта и Ломбардии.Возможно, виноделам здесь трудно не вспомнить Бароло или Вальтеллина, эти настойчивые танинные сорта только на западе. Но у этой виноградной зоны в Вероне, Венето, есть свои жемчужины. Четыре более сдержанных и чуть менее цепких купажа — только одна из которых — мощный Амароне — на основе местного винограда Корвина Веронезе превращаются в вина от свежих до жирных и сладких с использованием одного из четырех методов виноделия.

Верона славится своим красным вином еще со времен Римской империи.Сладкое вино с блестящим рубиновым оттенком, о котором писатели, такие как Кассиодор Сенатор, советник остготских королей в шестом веке, и Андреа Баччи, автор эпического семитомного винного гида De naturali vinorum Historia в шестнадцатом веке, так же восхищались блеском. ярко сейчас, как и тогда. И сегодня у тех, кто выпьет, есть еще больше стилей на выбор.

На самом деле, несмотря на всю свою известность, Amarone является относительным новичком, впервые коммерчески произведенным в 1950-х годах и случайным ответвлением многовекового сладкого стиля, который теперь официально получил название Recioto di Valpolicella DOCG.

«История вина — это история сладкого вина», — предлагают Фабио Менкарелли и Пьетро Тонутти, редакторы научно-исторического фолианта Сладкие, крепленые и крепленые вина: биохимия, технология и винификация винограда . Согласно местной легенде, оставленная на слишком долгое брожение партия Речото, которой не пользовались, обменяла остаточный сахар на сланцевую пикантность, сложность, основанную на танинах, и более высокий уровень алкоголя, чтобы технически стать recioto scappato , а в просторечии — amarone . , или горькое вино, которое затем было добавлено в модельный ряд Valpolicella.

Амароне в традиционном стиле содержит около 14 процентов алкоголя, что является более верной интерпретацией как винограда, так и культуры, чем более мясистые 17 процентов, которые часто включают в себя чужеродный виноград, чтобы удовлетворить международные вкусы: «Невозможно использовать виноград Вальполичелла, чтобы получить это. цвет и сладость », — говорит Паоло Фонтана из Tenute SalvaTerra об этих больших чернильных винах. «Мы хотим, чтобы продукт был более пригодным для питья, более типичным. Наша цель — создать кру-амароне». Чтобы достичь этого, SalvaTerra также обращается к редко используемым местным сортам винограда, таким как Оселета, который был спасен от исчезновения в 1970-х годах и разрешен в лучших винах с 2002 года.

В пословице «Сушка — это фирменный знак Веронезе» присутствует решающий штрих вальполичеллы, — объясняет Стефано Кампеделли из Marion Winery о знаменитых обезвоженных сортах винограда этой зоны. Он также указывает на бочки из словенского дуба вторичного использования как на древесину, которая лучше всего подходит для подлинного понимания терруара Вальполичеллы. Appassimento , или частичная сушка, происходит в определенных условиях в хорошо проветриваемых помещениях, известных как fruttaie , в которых целые грозди винограда либо уложены в один слой в штабелируемых ящиках, либо подвешены ослепительными фиолетово-синими листами, которые падают с потолка. на пол.

Соответствующая среда — ключ к успеху. Даже намек на ботритис, или благородную гниль, ценимую во французских сотернах и венгерских Токайи, испортит свежую, элегантно строгую смесь кислой вишни, сосны и более острых специй, таких как гвоздика и черный перец, которыми славится Вальполичелла. «Вино Amarone, одно из самых ценных вин в мире, является первым вином, в котором сушка является контролируемым процессом. [Дегидратация] изменяет виноград на биохимическом уровне и включает в себя специализированное управление виноградом, технологию послеуборочной обработки и производственные процессы. которые отличаются от типичной процедуры виноделия », — объясняют Менкарелли и Тонутти.

Даже намек на ботритис … испортит свежий, элегантно строгий микс из кислой вишни, сосны и более острых специй, таких как гвоздика и черный перец, которыми славится Вальполичелла.

Вишневые и оливковые деревья, все еще присутствующие здесь, доминировали в пейзаже всего несколько десятилетий назад: фрукты из первых когда-то были более прибыльными, чем вино. Ситуация изменилась с ростом известности Амароне. Сегодняшняя зона Вальполичелла — пальцеобразная серия из 11 долин, текущих к югу от Преальпс Лессини, между которыми возвышаются известняковые хребты, которая начинается у реки Адидже — тянется на восток и заканчивается только там, где начинается производство белого вина Соаве (виноделы у границы часто имеют виноградники в обеих областях и приведите примеры обоих наименований).На этих почвах, которые варьируются от известняка и базальта до красной и коричневой глины, королева королева с ароматом вишни, за ней следуют более темнокожие кислые корвиноны, затем рондинелла и молинара, в грубом порядке качества, а также менее известные сорта винограда. например, Оселета с мелкими ягодами и несколько международных сортов, таких как Каберне Совиньон.

Сочетание этих сортов винограда, всегда с Корвиной, является основой всех четырех стилей. Valpolicella DOC, перечный, мятный, свежий вишневый аналог Амароне и Речото, является самым основным вином этого наименования и единственным вином, изготовленным из не сушеного винограда, хотя в нем также может быть определенное количество сушеных.В 2007 году появился способ добавить веса и вкуса простой вальполичелле: путем перемешивания сусла годичного производства амароне или рециото и последующей повторной ферментации этой смеси. Valpolicella Ripasso DOC, последний стиль, более сложный и сложный, чем базовый, но более изысканный, чем Amarone (который иногда просто добавляется до 15 процентов вместо повторного использования).

От самых свежих вин Вальполичеллы, намекающих на ароматы, возникающие при сушке винограда, до винодельческих изысков, которые создают сердечную элегантность и типичность — вот некоторые из самых представительных вин зоны, которые можно открыть от закуски до десерта и после.

Производитель: Marion
Вино: Valpolicella Superiore, 2011
Розничная торговля: $ 28

Винодел в первом поколении Стефано Кампеделли основал Marion Winery всего двадцать лет назад в Вальполичелле Восток (земли, добавленные к зоне Классико в 1968 году, чтобы дать Италии официальный статус Вальполичеллы), но его корни в Вальполичелле сильны. Сын винного брокера, Кампеделли познакомился с энологом Селестино Гаспари, который тренировался у знаменитого местного Джузеппе Кинтарелли, затем он посоветовался с Гаспари, чтобы сделать свои вина Marion в поместье XV века с кипарисами и виноградниками, когда-то принадлежавшем аристократии. Семья Мариони.С сердечной, тонкой и явно вальполичеланской элегантностью, Кампеделли сохраняет верность и заботу о традициях региона. В качестве шутливого отсылки к легендарному использованию в этом районе appassimento , все вина Marion производятся с различным процентным содержанием сушеного винограда, в том числе базового сорта Вальполичелла.

«Superiore» на этикетке означает, что вино внутри выдерживается в течение одного года перед розливом в бутылки, что усиливает вкус свежих фруктов. Порция сушеного винограда (50 процентов корвина, 25 процентов корвинона и 25 процентов рондинелла) добавляет землистости фирменной яркости вишни и эвкалипта, а также нотам душистого перца, табака и кедра.

Производитель: Tenute SalvaTerra
Вино: Valpolicella Ripasso Classico Superiore, 2012
Розничная торговля: $ 16

Отель Tenute SalvaTerra расположен прямо на территории Классико, в поместье 16-го века на вилле Джиона в Сан-Пьетро-ин-Кариано. Отель Tenute SalvaTerra представляет собой сочетание страсти и практичности. Семья виноделов Фурия, поддерживаемая небольшой группой инвесторов, которые следят за бизнесом, делает вина обязательными как для места, так и для года.Акцент на винтаж и виноградники (окруженные оливковыми деревьями и кипарисами) и включение местных сортов винограда за пределами Корвины и Корвиноне делают вина сложными с мятным, ревеневым прохладным оттенком, хорошо сбалансированными танинами и кислотностью.

Вкус красной смородины и нотки сосны на грани розмарина — отличительные черты этого богатого дубильными и кислыми запахами Ripasso Superiore, а также живое и стойкое послевкусие. Изготовленное из свежего, не сушеного винограда (65 процентов Корвина, 10 процентов Корвиноне, 20 процентов Рондинелла, 5 процентов местных сортов, таких как Оселета), это вино было рипассато (повторно пропущенное) по сравнению с кожурой сухого винограда, используемой для Amarone 2012 года, затем выдерживался еще несколько месяцев перед розливом в бутылки.

Производитель: Санта София
Вино: Вальполичелла Рипассо Супериоре, 2012
Розница: $ 18

Вилла Санта-София, принадлежащая дворянину Маркантонио Серего, — винодельня Санта-София — делает Вальполичеллу свежей и пикантной с железными полосами минеральности. Некоторые из его подвалов расположены в бывшей церкви, построенной монахами в начале 14 века (которая служила часовней виллы более 250 лет спустя) и содержат большие бочки из словенского дуба Амароне и Рипассо.Другие вина Санта-Софии созревают в подвалах под самой виллой, а также в комнатах, где когда-то хранилось вино Серего. Элегантные и танинные, от базовых до амароне, Santa Sofia Valpolicellas являются идеальными компаньонами для местных блюд, таких как полента на гриле, паста биголи и рагу из дикого кабана.

Нежный, пикантный вкус с пряными нотами запеченных фруктов, это Рипассо было приготовлено из винограда фреш (70 процентов Корвина, 25 процентов Рондинелла, 5 процентов Молинара) с территорий Классико в Неграре, Фумане, Сан-Пьетро-ин. Кариано и Марано, затем использовались виноградные шкурки годового производства Амароне и Речото.Выдержанное в бутылках еще шесть месяцев, это вино демонстрирует легкие нотки обжаренного мяса и табака.

Производитель: Адалия Вино: Вальполичелла Рипассо Супериоре, 2013
Розница: $ 22

Еще один относительный новичок, виноградники Адалии, которые имеют общий газон с садами оливковых деревьев и вишневых деревьев Дуроне, а также неухоженный лес, занимают небольшие, всего пять гектаров, холмы, богатые известняком и известняком, в Валле-ди-Меццане Вальполичелла-Ист.Земля рассказывает о философии виноделия Адалии: разнообразное сельское хозяйство в гармонии с дикой землей и легким человеческим прикосновением. Эти легкие вальполичеллы сделаны из винограда, собранного вручную, а затем ферментированного с использованием местных дрожжей.

Яркое вишнево-красное пятно раскрывает секрет этого Рипассо: ноты красной сливы, мяты и гвоздики завершают это большое, яркое и удивительно фруктовое вино. Его делают обычным способом Рипассо, но с гораздо меньшим содержанием Корвины, чем в большинстве других: виноград фреш (30 процентов Корвина, 40 процентов Корвина Гросса, 20 процентов Рондинелла, 10 процентов Молинара), ферментированный в нержавеющей стали, а затем обработанный кожурой винограда Амароне. .

Производитель: Zenato
Вино: Amarone della Valpolicella Classico, 2010
Розничная торговля: $ 58

Эта винодельня во втором поколении находится в зоне Сант’Амброджо в Вальполичелла Классико. На территории площадью 35 гектаров засажены виноградные лозы Корвина, Рондинелла и Оселета, которые собирают вручную во время сбора урожая. Благодаря признанию журналов и книг, например, Gambero Rosso ‘Tre Bicchieri Award и включению vino dell’eccellenza в Le Guide de L’Espresso’s Vini d’Italia 2016 , вина Zenato богаты и доступны выражения традиционной Вальполичеллы.

Этот Amarone, который не может похвастаться глубоким непрозрачным рубиновым цветом, предлагает как фрукты (чернослив, засахаренная вишня), так и массу (эти танины!) Благодаря винограду (80 процентов Корвина, 10 процентов Рондинелла, 10 процентов Оселета), которые были выращены. оставить сохнуть до четырех месяцев. Это простое, удовлетворительное выражение этого великолепного винного стиля, в котором можно попробовать (и увидеть) высокий процент корвины и добавление оселеты. Говорят, что Амароне из области Классико обладает дубильными свойствами, аналогичными Бароло и Барбареско: Зенато доказывает это, сохраняя при этом фруктовость Вальполичеллы.

Производитель: Валентина Куби
Вино: Recioto della Valpolicella Classico, Meliloto, 2003
Розничная торговля: 52 доллара (500 мл)

Валентина Куби устанавливает свои собственные правила с тех пор, как ее муж, энолог-консультант, купил несколько акров виноградников в нескольких шагах от озера Гарда, а затем слишком долго обрабатывал их. Обеспокоенная тем, что земля заброшена, в то время как ее муж много часов работал в другом месте, Куби решила научиться ухаживать за виноградниками Вальполичеллы и делать вино Вальполичелла, уделяя особое внимание местному винограду Корвина.Она превратила виноградники в органические, выделив часть сегодняшних 13 гектаров под оливковые рощи, и приняла интегрированные методы ведения сельского хозяйства, такие как компостирование и покровные культуры — решения, которые снискали ей репутацию как бунтаря, так и винодела Ваполичеллы.

Вино, которое также может быть сладким и строгим, Meliloto изготовлено из винограда (70 процентов Корвина, 25 процентов Корвинона, 5 процентов Рондинелла), собранного вручную в районах Фумане и Сан-Пьетро в Кариано, высушенных в течение четырех месяцев. , а затем оставьте на несколько месяцев для медленного брожения на кожуре, по возможности без контроля температуры.

Взгляд на биопестициды на основе РНКи

Front Plant Sci. 2020; 11: 51.

Стивен Дж. Флетчер

¹ Центр садоводческих наук, Квинслендский альянс за сельское хозяйство и пищевые инновации, Квинслендский университет, Сент-Люсия, Квинсленд, Австралия

Филип Т. Ривз

² Независимый Исследователь, Канберра, АКТ, Австралия

Бао Трам Хоанг

¹ Центр садоводческих наук, Квинслендский альянс за сельское хозяйство и пищевые инновации, Университет Квинсленда, Сент-Люсия, QLD, Австралия

Neena Mitter

¹ Center для садоводства, Квинслендский альянс за сельское хозяйство и пищевые инновации, Университет Квинсленда, Сент-Люсия, QLD, Австралия

² Независимый исследователь, Канберра, ACT, Австралия

Отредактировал: Andr ás Székács, Национальный центр сельскохозяйственных исследований и инноваций, Венгрия

Рецензент: Huipeng Pan, Южно-Китайский сельскохозяйственный университет, Китай; Антонио Фигейра, Университет Сан-Паулу, Бразилия; Руобин Гуань, Шанхайский институт биологических наук (CAS), Китай; Сюэся Мяо, Шанхайский институт биологических наук (CAS), Китай

Эта статья была отправлена ​​в раздел «Взаимодействие с растительными микробами» журнала «Границы в науке о растениях»

Поступила в редакцию 29 октября 2019 г .; Принята в печать 15 января 2020 г.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (CC BY). Использование, распространение или воспроизведение на других форумах разрешено при условии указания автора (авторов) и правообладателя (ов) и ссылки на оригинальную публикацию в этом журнале в соответствии с принятой академической практикой. Запрещается использование, распространение или воспроизведение без соблюдения этих условий.

Abstract

Устойчивое сельское хозяйство опирается на практики и технологии, сочетающие эффективность с минимальным воздействием на окружающую среду. РНК-интерференция (РНКи), эукариотический процесс, в котором экспрессия транскриптов снижается в зависимости от последовательности, может быть использована для борьбы с вредителями растений и патогенами в системе местного нанесения. Было показано, что двухцепочечная РНК (дцРНК), ключевая триггерная молекула РНКи, обеспечивает защиту без необходимости интеграции конструкций, экспрессирующих дцРНК, в виде трансгенов.Следовательно, разработка биопестицидов на основе РНК набирает обороты в качестве узкоспектральной альтернативы мерам контроля на основе химических веществ, с точным и конкретным нацеливанием на вредителей и патогены. Ограничения, которые необходимо преодолеть для коммерчески жизнеспособного продукта, включают стабильную доставку применяемой местно дцРНК и увеличение продолжительности защиты. В дополнение к исследованиям, направленным на доставку дцРНК, разработка нормативной базы, идентификация рисков и разработка стратегий предотвращения и смягчения последствий является ключом к широкому распространению актуальных технологий РНКи.После принятия эти меры обеспечат отрасли защиты растений уверенность, необходимую для расходования ресурсов на разработку инновационных продуктов на основе дцРНК. Очевидные риски для здоровья человека кажутся минимальными, с множеством препятствий для поглощения и долгой историей потребления дцРНК из растительного материала. Ожидается, что непреднамеренное воздействие на окружающую среду будет наиболее очевидным для видов, тесно связанных с целью. Целостные методы проектирования, которые включают отбор дцРНК на основе биоинформатики наряду с экспериментальным тестированием, представляют собой важные методы устранения неблагоприятных воздействий.

Ключевые слова: РНКи, биопестицид, местное применение, дцРНК, защита растений

Общие сведения

Ожидается, что в ближайшие десятилетия спрос на мировое сельское хозяйство возрастет, а к 2050 году население, вероятно, вырастет до ~ 9 миллиардов (Организация для сотрудников по вопросам экономического сотрудничества и развития и Организации экономического сотрудничества и развития., Экологические перспективы ОЭСР до 2050 года, Экологические перспективы ОЭСР, ОЭСР, Париж, 2012 г.). Ожидается, что многие дополнительные факторы усугубят проблемы, с которыми сталкивается мировое сельское хозяйство, в том числе переход к более широкому потреблению более питательных продуктов в развивающихся странах с улучшающейся экономикой, сокращение пахотных земель из-за расширения городов и деградации земель, и, возможно, самое главное, неблагоприятные последствия. вызвано изменением климата (FAO, 2009).Воздействие, связанное с изменением климата, может включать снижение урожайности из-за повышения температуры и экстремальных погодных явлений, а также увеличение потерь из-за расширения и изменения ареалов вредителей и патогенов сельскохозяйственных культур (Chakraborty and Newton, 2011; IPCC, 2014).

Соответственно, устойчивый рост урожайности перед лицом глобальных ограничений производства является необходимостью. Одна из областей, где можно добиться значительного повышения продуктивности, — это ограничение потерь урожая, связанных с вредителями и патогенами. В настоящее время устойчивые сорта, химические пестициды и комплексные методы управления являются наиболее эффективными методами решения биотических проблем.Однако со второй половины прошлого века возросла обеспокоенность по поводу использования химических пестицидов, в частности их воздействия на здоровье человека и окружающую среду, включая отсутствие дифференциации целевых и нецелевых организмов в способах их действия. , и повсеместное развитие устойчивости к пестицидам. Следовательно, разработка инновационных и экологически устойчивых подходов к защите растений приобретает все большее значение.

Среди наиболее заметных сдвигов парадигмы в сельском хозяйстве за последние 50 лет — коммерческое внедрение генетически модифицированных организмов (ГМО).Такие культуры, как хлопок, кукуруза и соя, были спроектированы таким образом, чтобы быть устойчивыми к определенным вредителям и патогенам, что делает их основными товарами на многих рынках. Однако серьезными препятствиями на пути внедрения ГМО были признание сообщества, затраты и время, получение разрешения регулирующих органов и отсутствие протоколов трансформации для многих видов сельскохозяйственных культур. Здесь мы представляем перспективу разработки, ограничений и рисков, связанных с продуктами на основе дцРНК, не содержащими ГМО, которые нацелены на использование РНКи для обеспечения защиты от вредителей и патогенов сельскохозяйственных культур целенаправленным образом без необходимости генетической модификации растений.

Функциональная основа продуктов на основе дцРНК: РНКи

РНКи включает консервативный набор механизмов, которые эукариоты используют для регулирования количества транскриптов РНК. Физиологические последствия РНКи были впервые идентифицированы почти столетие назад Уингардом, который наблюдал на табаке, что инфекция, вызванная вирусом кольцевой пятнистости табака, в нижних листьях была связана с устойчивостью ко вторичной инфекции в верхних листьях (Wingard, 1928). Появление генетических модификаций растений и грибов привело к наблюдениям, что интеграция трансгенов, гомологичных эндогенным генам, иногда приводила к подавлению экспрессии обоих, процесс, называемый «совместная супрессия» у растений (Napoli et al., 1990) и «подавление» грибов (Romano, Macino, 1992). Впоследствии защитный характер процесса был продемонстрирован совместным подавлением вирусных транскриптов с трансгеном, экспрессирующим часть белка оболочки (CP) вируса травления табака, способного индуцировать замедленную устойчивость к вирусной последовательности-специфическому способу (Lindbo et al. ., 1993). Fire et al. установили, что у нематоды Caenorhabditis elegans двухцепочечная РНК (дцРНК) была гораздо более мощным супрессором экспрессии транскрипта-мишени, чем одноцепочечная РНК (оцРНК) (Fire et al., 1998). Это открытие, за которое Файер и соавтор Мелло были удостоены Нобелевской премии, ознаменовало рождение революции RNAi.

Практическое применение РНКи быстро развивалось, при этом экспрессируемая трансгеном дцРНК применялась для индукции устойчивости к вирусам и подавления генов у растений (Waterhouse et al., 1998). В последующие годы были выяснены другие компоненты пути. Посредники в виде небольших антисмысловых РНК размером ~ 25 нуклеотидов были идентифицированы как направляющие для деградации РНК-мишени (Hamilton and Baulcombe, 1999; Zamore et al., 2000). Далмей и его сотрудники показали, что РНК-зависимая РНК-полимераза RDR6 была задействована для генерации дцРНК из транскриптов-мишеней в растениях, что привело к петле обратной связи увеличения количества малой интерферирующей РНК (миРНК) и потенциала к молчанию (Dalmay et al., 2000) . Этот процесс также очевиден у грибов и нематод (Baulcombe, 2004). Другие идентифицированные затем фундаментальные компоненты включали фермент, содержащий домен РНКазы III, ответственный за расщепление дцРНК в Drosophila , который был назван «Дайсер» (Bernstein et al., 2001). Дайсер-подобные гены также были обнаружены у растений и грибов (Jacobsen et al., 1999; Schauer et al., 2002). Члены консервативного семейства Argonaute были признаны компонентами комплекса РНК-индуцированного сайленсинга (RISC), который опосредует расщепление транскрипта-мишени (Liu et al., 2004; Baumberger and Baulcombe, 2005). Таким образом, основные составляющие пути РНКи были идентифицированы с применением механизма, быстро развивающегося в биологических областях.

С точки зрения анализа риска выяснение многих компонентов пути РНКи имело важные последствия для приложений борьбы с вредителями и патогенами.Было продемонстрировано, что РНКи очень специфична к последовательности, что позволяет кратко направить дцРНК на транскрипты для деградации, однако консервативный характер пути среди эукариот влечет за собой то, что непреднамеренное воздействие на организмы, не являющиеся мишенями (NTO), может быть очевидным в присутствии дцРНК, если существовала достаточная гомология транскриптов.

РНКи для защиты от вредителей и патогенов растений

Важным фактором, продвигавшим РНКи в качестве меры защиты растений, было наблюдение, что реакция растения на вторжение вируса функционально связана с ответом на трансгены [e.g., (Ratcliff et al., 1997; Ruiz et al., 1998)]. Неклеточно-автономная природа RNAi у растений с локальным и системным перемещением сигналов молчания на большие расстояния указывает на то, что кооптация пути может обеспечивать высокоселективную системную резистентность (Tenllado et al., 2004). Хотя растения ранее трансформировали одноцепочечными конструкциями для индукции устойчивости к вирусу, преимущества экспрессии дцРНК стали очевидными, когда были охарактеризованы компоненты пути РНКи. Используя конструкцию шпильки, Wang et al.генерировал полную устойчивость к вирусу желтых карликов ячменя-PAV в трансгенном ячмене, демонстрируя эффективность этого метода на важной товарной культуре (Wang et al., 2000).

Хотя РНКи ранее использовались в качестве инструмента для изучения функции генов у насекомых (Belles, 2010), Baum et al. разработали пероральный (с помощью искусственной диеты или трансгенной кукурузы) РНКи-подход для индукции смертности западного корневого червя кукурузы ( Diabrotica virgifera virgifera LeConte) через , нацеленный на различные субъединицы V-АТФазы вместе с α-тубулином (Baum et al. ., 2007). В том же году Мао и др. сообщили о нарушении роста хлопковой совки ( Helicoverpa armigera ) при скармливании материала листьев растений, экспрессирующих дцРНК, специфичную для гена цитохрома P450 (Mao et al., 2007). Одобрение первых коммерческих разновидностей ГМО, экспрессирующих дцРНК против насекомых-вредителей, не произойдет до 2017 года, когда кукуруза SMARTSTAX PRO от Monsanto и Dow будет включать дцРНК против другого гена западного кукурузного корневого червя, Snf7 (Head et al., 2017).Примерно в то же время было получено разрешение на экспрессию дцРНК яблока и картофеля для регуляции экспрессии эндогенных генов для повышения качества (Waltz, 2015; Baranski et al., 2019).

Помимо вирусов и насекомых, РНКи также была принята для борьбы со многими другими вредителями растений и патогенами в условиях исследований, включая такие бактерии, как Agrobacterium , грибы, такие как мучнистая роса, и нематоды, такие как нематоды корневых узлов ( Роза и др., 2018). Однако ограничения подхода генетической модификации к защите сельскохозяйственных культур были очевидны в течение некоторого времени и включают низкий уровень признания общественности на многих рынках и неспособность генетически трансформировать многие виды сельскохозяйственных культур (Zotti et al., 2018). Соответственно, большая часть недавнего внимания к РНКи для защиты растений сместилась в сторону нетрансформирующих стратегий (Dalakouras et al., 2019).

Разработка РНКи для местного применения

Функциональное внекорневое нанесение дцРНК, нацеленных на вирусы растений, вирус легкой крапчатости перца (PMMoV), вирус мозаики люцерны (AMV) и вирус травления табака (TEV) были впервые описаны Тенлладо и его сотрудниками в 2001 (Тенлладо и Диас-Руис, 2001). В заявлении, которое должно было оказаться даром предвидения, авторы отметили, что местное применение дцРНК in vitro, экспрессируемой , для защиты от вирусов растений может быть коммерчески жизнеспособным, если производство дцРНК станет недорогим и будут разработаны адекватные средства доставки (Tenllado and Diaz- Руис, 2001).Те же авторы попытались снизить стоимость дцРНК, применив неочищенный экстракт E. coli HT115, экспрессирующий те же самые фрагменты дцРНК, которые использовались ранее, и достигли аналогичных положительных результатов с вирусной совместной инокуляцией, хотя окно устойчивости было ограничено до от пяти до семи дней (Tenllado et al., 2003). Однако очевидны дополнительные риски такого подхода по сравнению с применением очищенной дцРНК. К ним относятся возможность токсичных побочных продуктов ферментации, присутствие селективных антибиотиков, используемых в питательной среде, и неопределенный ГМО-статус неочищенного продукта.

После новаторской работы Тенлладо и его сотрудников за последующее десятилетие появилось ограниченное количество отчетов. Ган и его сотрудники создали дцРНК для местного применения против белка оболочки вируса мозаики сахарного тростника с использованием системы HT115, разработанной ранее Тенлладо (Gan et al., 2010). Lau et al. также использовали бактериальные экстракты для генерации дцРНК против белка оболочки вируса мозаики Cymbidium (Lau et al., 2014). В последние годы защита от многих вирусов растений из нескольких семейств была успешно обеспечена путем местного применения дцРНК (Mitter et al., 2017а).

Учитывая разрушительное воздействие грибковых патогенов на урожай сельскохозяйственных культур во всем мире, успешное местное применение дцРНК для борьбы с грибковой инфекцией было значительным. Koch et al. показали, что рост Fusarium graminearum можно ингибировать путем прямого нанесения на отделенные листья ячменя дцРНК, нацеленной на три гена CYP450 (Koch et al., 2016). Важно отметить способность подавлять рост грибка, системно распространяющийся в листе, контролируя патоген на необработанных участках.В недавней публикации Höfle et al. продемонстрировали влияние длины распыленной дцРНК на эффективность индивидуального нокдауна F. graminearum гена CYP, причем конструкции> 1500 п.н. были намного менее эффективны, чем конструкции 200-500 п.н. (Höfle et al., 2019). Путем нацеливания на два Dicer-подобных гена в Botrytis cinerea , Ван и его сотрудники эффективно контролировали патоген на поверхности фруктов, овощей и цветов, демонстрируя, что РНКи могут играть роль в защите сельскохозяйственных продуктов после сбора урожая в дополнение к предварительным -защита урожая (Wang et al., 2016). McLoughlin et al. также смогли уменьшить грибковую инфекцию и уменьшить симптомы у B. cinerea , а также Sclerotinia sclerotiorum , за счет листовой подкормки дцРНК на Arabidopsis и Brassica napus листьев (McLoughlin et al., 2018) .

По сравнению с вирусами и грибами, разработка стратегий местной РНКи для защиты от членистоногих-вредителей была технически сложной по целому ряду причин, включая отсутствие амплификации сигнала подавления РНКи и деградацию дцРНК во время проглатывания (Niu et al., 2018). Хотя было показано, что пероральное поглощение дцРНК, нацеленных на критические гены, вызывает смертность у некоторых членистоногих, перенос доставки с искусственной диеты на стратегию местного применения оказался трудным. Когда членистоногие вредители захватывают дцРНК / миРНК с поверхности растения или из внутренних тканей, таких как сосудистые пучки, количество дцРНК / миРНК, транспортируемых в клетки, где они эффективны, сравнительно невелико без принятия мер защиты и усиления поглощения (Niu et al. al., 2018). Кроме того, исследование Biedenkopf et al. указывает на то, что количество эффекторов РНКи и их способность вызывать молчание уменьшается с удалением от места экзогенного применения (Biedenkopf et al., 2019). Интересно, что авторы отметили, что в случае ячменя местно применяемая дцРНК проникает в растение и системно распространяется на листья, побеги и корни через флоэму . Также было очевидно, что интернализованная дцРНК, по крайней мере, частично процессируется в миРНК, которые также могут быть обнаружены в дистальных тканях.Однако в некоторых обстоятельствах эти технические препятствия оказались преодолимыми. Было признано, что жесткокрылый колорадский жук очень чувствителен к дцРНК, наносимой на листья, что было продемонстрировано Сан-Мигелем и Скоттом на листьях картофеля (San Miguel and Scott, 2016). Методы внекорневого применения также оказались успешными: поглощение корнями целевых дцРНК приводит к гибели коричневых цикад и азиатских кукурузных мотыльков (Li et al., 2015).

Из-за обхода генетической модификации культуры-хозяина решаются основные препятствия для принятия эффективных подходов к применению местной РНКи, включая негативное общественное восприятие продукции на основе ГМ и неспособность трансформировать многие важные сельскохозяйственные виды.Текущие исследования и разработка технологий РНКи для местного применения обычно сосредоточены на двух темах: выбор максимизирующих смертность генов-мишеней, специфичных для данного вида, и обеспечение достаточной стабильности дцРНК для местного применения для оптимального окна защиты. Подходы, основанные на биоинформатике, широко использовались для смягчения нецелевого воздействия на этапе проектирования и обсуждаются ниже. Стабилизация дцРНК — это многогранная проблема, которая обычно зависит от сценария применения.Деградация дцРНК в окружающей среде может происходить через действия рибонуклеаз и / или УФ-излучения, которые широко распространены в сельскохозяйственных условиях. Стабильность дцРНК, нацеленной на членистоногих, также должна быть достаточной для приема внутрь, что требует сохранения в кишечных условиях с ненейтральным pH перед доставкой в ​​соответствующие ткани. Использование наноносителей в качестве компонентов системы доставки — вариант преодоления этих препятствий. Наноматериалы имеют размеры менее 100 нм, что приводит к высокому соотношению площади поверхности к объему, и могут быть разработаны с защитными свойствами и свойствами медленного высвобождения для своих полезных нагрузок (Ghormade et al., 2011). Здесь мы представляем тематическое исследование по доставке дцРНК с использованием наночастиц глины в качестве носителей, направленное на решение некоторых проблем, связанных с применением голой дцРНК.

Практический пример — Биоглина для защиты и медленного высвобождения дцРНК на поверхности растений

Новаторская работа Тенлладо и его сотрудников над местно применяемыми РНКи определила короткое окно защиты, обеспечиваемое листвой, как препятствие для широкого распространения технологии (Tenllado и Diaz-Ruiz, 2001).Это также было идентифицировано как ключевой фактор в различных публикациях, появившихся в последнее десятилетие по тематическому применению РНКи [например, (Yu et al., 2013; Zotti et al., 2018)].

Mitter et al. исследовали использование дцРНК в комплексе с нанолистами слоистого двойного гидроксида (LDH), названных BioClay, в качестве распыления () (Mitter et al., 2017b). Использование BioClay позволило расширить окно защиты от вирусных патогенов до 20 и более дней. Важно отметить, что сама ЛДГ является биосовместимой и используется в терапии человека (Del Hoyo, 2007; Kuthati et al., 2015). ЛДГ также безопасно разлагается в умеренно кислых условиях, тем самым сводя к минимуму риск чрезмерного сохранения дцРНК в окружающей среде. Снижение риска при сохранении эффективности потребует аналогичных новых решений при разработке многих продуктов на основе РНКи, что указывает на преимущества выявления рисков на самых ранних этапах разработки.

Местное нанесение BioClay обеспечивает расширенную РНКи-опосредованную защиту от вирусов растений. BioClay представляет собой комплекс двухцепочечной РНК (дцРНК) и слоистого двойного гидроксида (ЛДГ).Биоглину получают путем смешивания дцРНК и ЛДГ в растворе и применяют в виде опрыскивания для листвы. Влага и углекислый газ объединяются, обеспечивая кислотное высвобождение дцРНК, при этом ЛДГ разлагается на его составляющие. Затем дцРНК может захватываться растением и запускать его РНК-механизм для разрушения гомологичных вирусных РНК. Благодаря стабилизации и медленному высвобождению дцРНК устойчивость к целевому вирусу по сравнению с голой дцРНК может увеличиваться с дней до недель.

Снижение и предотвращение рисков, связанных с продуктами на основе RNAi

Все технологии, как используемые в настоящее время, так и новые, несут в себе набор рисков, которых можно либо избежать, либо смягчить путем выявления, тщательного планирования и проектирования, а также методов безопасного использования .Хотя технологии на основе RNAi предлагают очевидные и очевидные преимущества в плане безопасности по сравнению со многими существующими средствами защиты растений, анализ риска по-прежнему является ключом к их внедрению. Обобщенные риски, связанные с применением дцРНК в окружающей среде, можно разделить на две области: непреднамеренное воздействие на здоровье человека и непреднамеренное воздействие на окружающую среду в целом (). В сочетании с другими агентами в составе, анализ риска компонента дцРНК менее универсален и должен изучаться в каждом конкретном случае.

В качестве меры защиты растений местно применяемая дцРНК должна быть эффективной против конкретных вредителей и патогенов, избегая при этом нежелательных нежелательных последствий. Местно применяемая двухцепочечная РНК (дцРНК) может использоваться для создания устойчивости к патогенным вирусам и грибам, а также вредителям, таким как насекомые. Нецелевые воздействия, которых следует избегать, включают молчание важнейших генов растений-хозяев и других генов нецелевых организмов. Потенциальные пути воздействия на людей, включая операторов, применяющих дцРНК, вместе с потребителями обработанных продуктов, могут происходить через воздействие на кожу, вдыхание и проглатывание .

Риски для здоровья человека

Существует три основных пути воздействия дцРНК на человека при местном применении: прием внутрь, вдыхание и через кожу. Чтобы дцРНК вызывала клеточный ответ у человека, ей необходимо пройти через множественные и повторяющиеся барьеры независимо от пути воздействия. Предполагаемые воздействия интернализованной дцРНК могут быть независимыми от последовательности и / или специфичными для последовательности. Люди обладают врожденной иммунной системой, которая распознает дцРНК неспецифическим образом через множественных рецепторов (DeWitte-Orr et al., 2009; Whitehead et al., 2011). Подобно ситуации у других высших эукариот, у человека дцРНК может распознаваться клеткой как патогенная сигнатура, которая затем может вызывать интерфероновый ответ. Примечательно, что создание такой реакции при вдыхании или проглатывании является сложной задачей. Люди имеют долгую историю потребления с пищей значительных количеств дцРНК из зараженного вирусом растительного материала без каких-либо признаков обнаруживаемых эффектов, вероятно, из-за быстрой деградации нуклеиновых кислот в желудке в первую очередь (Jensen et al., 2013). Было проведено несколько исследований неспецифического воздействия на последовательность дцРНК через путем ингаляции в качестве синтетического аналога дцРНК полиинозиновой: полицитидиловой кислоты (поли I: C), которая отличается своей способностью вызывать воспаление и гиперчувствительность. ответ, обычно используется в исследованиях мышей и клеточных линий в качестве замены дцРНК [например, (Mahmutovic-Persson et al., 2014)]. Также было показано, что нанесение поли (I: C) посредством инъекции под струпья ран мыши индуцирует синтез ретиноевой кислоты и регенерацию волосяных фолликулов (Kim et al., 2019), хотя такой путь воздействия на человека не может считаться обычным явлением для биопестицидов на основе РНКи.

Считается, что дцРНК представляет собой значительный риск для здоровья человека в зависимости от последовательности, поскольку дцРНК должна перемещаться внутри клетки, а не к рецепторам на ее поверхности. Неспособность успешно разработать терапию на основе РНКи указывает на масштаб проблемы доставки (Chen et al., 2018). Нестабильность некодирующих РНК в биологических жидкостях из-за обилия эндогенных нуклеаз и последующее удаление через почки , а также неспособность преодолевать сосудистые и клеточные барьеры называются ключевыми ограничениями (Chen et al., 2018). Аналогичным образом будет затронута дцРНК окружающей среды без специальных защитных мер. Дополнительным ограничением для введенных дцРНК или siRNA, происходящих от дцРНК, является то, что эти последовательности должны иметь достаточную гомологию с эндогенными транскриптами, чтобы вызвать деградацию транскрипта. Даже когда эта гомология очевидна, несколько исследований показали, что любое воздействие, вероятно, будет незначительным, вероятно, из-за вышеупомянутых ограничений доставки. Петрик и его сотрудники провели 28-дневные токсикологические испытания с использованием дцРНК и миРНК на моделях мышей (Petrick et al., 2015). Даже при обильном потреблении дцРНК и миРНК, полностью гомологичных гену вАТФазы мыши, не было очевидного подавления экспрессии гена или каких-либо физиологических воздействий. В самом деле, потребление растительного материала, содержащего дцРНК, способную генерировать siRNA, гомологичную человеческим транскриптам, является дополнительным признаком того, что специфичные для последовательности воздействия, вероятно, необоснованны, по крайней мере, в пути приема внутрь (Jensen et al., 2013). Как отмечается в Food Standards Australia Новой Зеландии в отношении потребления дцРНК из ГМО: «Нет никаких научных оснований предполагать, что небольшие дцРНК, присутствующие в некоторых ГМ-продуктах, имеют другие свойства или представляют больший риск, чем те, которые уже естественным образом присутствуют в обычных продуктах питания». (FSANZ, 2013).Однако приготовление продуктов на основе дцРНК с другими компонентами может повлиять на пути воздействия на человека и может потребовать оценки в каждом конкретном случае.

Риски для окружающей среды

Непредвиденные экологические последствия продуктов на основе RNAi часто зависят от конкретного случая. Например, полезное насекомое, не являющееся мишенью, которое тесно связано с насекомым-вредителем-мишенью, может быть аналогичным образом восприимчивым к РНКи окружающей среды. Если бы существовала достаточная гомология последовательности дцРНК с ключевым геном, а полезное насекомое имело аналогичный диапазон и режим питания, можно было бы спрогнозировать сопоставимые эффекты в отношении смертности.Пример такого нецелевого воздействия на родственные виды насекомых продемонстрирован Baum et al., (2007). Четыре вида жесткокрылых получали дцРНК, предназначенную для индукции смертности. Целевой западный корневище кукурузы (WCR) вместе с южным корневым червем кукурузы демонстрировал значительную смертность при потреблении дцРНК, нацеленной на WCR V-ATPase A . Колорадские жуки (CBP) также показали значительную смертность, но дцРНК была менее эффективна, чем та, которая непосредственно нацелена на CPB V-ATPase A .Наконец, хлопковый долгоносик не погиб даже при наличии дцРНК, нацеленной на эндогенную V-АТФазу A CWV . Восприимчивость к дцРНК может варьироваться между видами, что делает точное предсказание нокдауна гена сложной задачей. У насекомых виды жесткокрылых обычно считаются наиболее восприимчивыми к РНКи, причем двукрылые и перепончатокрылые иногда восприимчивыми, а чешуекрылые и полуперепончатые — редко (Baum and Roberts, 2014; Christiaens et al., 2018).

Развитие сельскохозяйственных культур, экспрессирующих дцРНК против насекомых-вредителей, привело к ряду исследований, оценивающих риски, связанные с их распространением.Велес и др. исследовали влияние на медоносных пчел ( Apis mellifera L) пыльцы кукурузы, экспрессирующей дцРНК, нацеленную на транскриптов V-ATPase A либо целевого WCR, либо того же транскрипта в самой пчеле (Velez et al., 2016). Не было очевидного влияния дцРНК на выживаемость на личиночной или взрослой стадии, что указывает на то, что медоносные пчелы не всегда восприимчивы к дцРНК окружающей среды даже при полной гомологии последовательностей. Аналогичным образом Tan et al. протестировали дцРНК, направленную против транскрипта WCR DvSnf7 (Tan et al., 2016). Даже при более высоких концентрациях, чем в поле, никакого воздействия на личинок или взрослых пчел не наблюдалось. В подходе, сравнимом с Vélez et al., Pan и соавт. Оценили влияние WCR и эндогенных дцРНК V-ATPase A на новорожденных бабочек-монархов ( Danaus plexippus L) (Pan et al., 2017). Не было очевидного влияния на экспрессию или выживаемость целевого гена. Как и медоносная пчела, бабочка-монарх не оказалась восприимчивой к РНКи окружающей среды.Пан и его сотрудники также исследовали потенциальные риски РНКи окружающей среды для тонких коллембол ( Sinella curviseta ), снова используя WCR и эндогенную V-ATPase A , нацеленную на дцРНК (Pan et al., 2016). На основе анализа искусственного питания авторы пришли к выводу, что неблагоприятное воздействие на почвенных членистоногих было незначительным. Haller et al. использовали дцРНК WCR V-ATPase A для определения ответов двух видов жесткокрылых божьих коровок ( Adalia bipunctata и Coccinella septempunctata ) (Haller et al., 2019). Как и другие виды жесткокрылых, божьи коровки были чувствительны к дцРНК, вводимой с пищей, хотя вводимые концентрации были намного выше, чем ожидалось в полевых условиях. Примечательно, что степень негативного воздействия была связана с количеством гомологичных совпадающих субпоследовательностей 21nt для обоих видов, при этом шесть соответствовали транскрипту A. bipunctata и 34 соответствовали мРНК C. septempunctata .

По мере того, как последовательности-мишени становятся менее консервативными, вероятность индукции вредных эффектов вне мишени снижается из-за неспособности продуцировать достаточное количество гомологичных siRNA вне мишени.Хотя генетически он отличается от мишени, одним конкретным нецелевым организмом, который всегда может вступить в контакт с нанесенной дцРНК, является сам урожай. Эффективность наносимой на листья дцРНК против вирусов растений указывает на то, что по крайней мере часть пула дцРНК интернализуется растением, которое затем настраивает систему РНКи хозяина против вирусных РНК. Такие методы, как параллельный анализ концов РНК (PARE), были предложены для идентификации эндогенных мРНК-мишеней в растениях, экспрессирующих дцРНК (Casacuberta et al., 2015). Такие молекулярные методы также могут быть полезны при обнаружении нецелевого воздействия на виды сельскохозяйственных культур после применения биопестицидов на основе РНКи.

Для противодействия непреднамеренному воздействию на близкородственные полезные виды и, действительно, на любые другие нецелевые виды, с которыми может вступать дцРНК, понимание условий, в которых будет применяться технология РНКи, является ключевым, наряду с тщательным выбором последовательности-мишени. и последующий дизайн, основанный на биоинформатике.

Биоинформатика для идентификации и смягчения нецелевых воздействий

Деградация транскриптов аппаратом РНКи направляется миРНК длиной ~ 21–22 нт, которые генерируются с помощью дайсера из примененной дцРНК.Пул всех возможных смысловых и антисмысловых последовательностей миРНК, полученных из дцРНК, может быть вычислен с помощью вычислений, что позволяет просто идентифицировать гомологичные нецелевые транскрипты. Степень гомологии, необходимая для эффективного индуцирования нокдауна экспрессии, варьируется и остается областью постоянных исследований. Например, исследования кормления насекомых показали, что одно или несколько совпадений по 19 нуклеотидов между дцРНК и транскриптом могут снизить экспрессию транскрипта, что может иметь пагубные последствия, если дцРНК в окружающей среде будет в достаточном количестве (Christiaens et al., 2018).

Принимая осторожный подход к дизайну дцРНК, можно выбрать области генов-мишеней, чтобы гарантировать минимизацию гомологии с транскриптами вне мишени, а также выявить и избежать любых смежных совпадений, превышающих установленный предел (Naito et al., 2005). OfftargetFinder, веб-приложение, разработанное Good и соавторами, служит примером такого подхода (Good et al., 2016). Используя базу данных членистоногих и других ключевых видов, программное обеспечение указывает, какие виды, не попавшие в цель, имеют 21 совпадение, и позволяет оператору тестировать различные области целевого гена, чтобы минимизировать попадания вне цели.Это приложение использовалось для исследования генов-мишеней CBP и WCR ( β-actin и DvSnf7 соответственно) на предмет предполагаемых нецелевых воздействий на божью коровку Coleomegilla macula и красного мучного жука Tribolium castaneum (Allen, 2017). Другой распространенный подход к выявлению попаданий вне цели — использование поискового инструмента BLAST. Например, Ulrich et al. использовали BLAST для идентификации смежных совпадающих областей размером 17nt или более между выбранными видами насекомых, не являющимися мишенями, и генами-мишенями РНКи, идентифицированными в крупномасштабном скрининге T.castaneum (Ulrich et al., 2015).

Есть два предостережения в отношении использования вышеупомянутых подходов, поскольку отбор, основанный на биоинформатике, не может быть единственным арбитром непреднамеренных воздействий дцРНК. Во-первых, нецелевые виды, обладающие транскриптом с гомологией выше произвольного уровня, могут не пострадать по множеству причин; дцРНК может не приниматься или она может не транспортироваться в клетку, где экспрессируется нецелевой транскрипт (как это, вероятно, имеет место у млекопитающих), деградация транскрипта может не иметь никакого влияния из-за избыточности или других факторов, все из которых не оказывают заметного физиологического воздействия.Следовательно, биоинформатический анализ, основанный только на гомологии, вероятно, значительно переоценит вероятность нецелевого воздействия, особенно с учетом низкой численности каждой дискретной миРНК, генерируемой из дцРНК.

Второй недостаток анализов на основе биоинформатики — это отсутствие информации о геноме и транскриптоме, доступной в настоящее время для определенных полезных и не вредных организмов. К счастью, поскольку затраты на секвенирование генома быстро снижаются, доступность новых данных о последовательностях, которые могут использоваться для таких анализов, продолжает расти.Однако может потребоваться целенаправленное определение последовательности для заполнения пробелов в знаниях в конкретных обстоятельствах.

Несмотря на эти предостережения, очевидно, что целостный подход к предотвращению и снижению рисков включает в себя биоинформатический дизайн в качестве компонента, но также сильно зависит от биологических данных и понимания биологических и экологических систем, в которых будет использоваться дцРНК. .

Пример: нормативно-правовая среда в Австралии, относящаяся к продуктам на основе дцРНК для местного применения в растениях

Критическим шагом в выводе инновационных продуктов на рынок является диалог между разработчиками и регулирующим органом.Это действие не только обеспечивает общественную и экологическую безопасность, но и дает уверенность застройщикам. Здесь мы представляем тематическое исследование анализа австралийскими регулирующими органами того, где продукты с РНКи местного применения соответствуют существующему правовому ландшафту.

До 8 ^th октября 2019 года продукты на основе RNAi для местного применения в Австралии регулировались Управлением регулятора генных технологий (OGTR) и Австралийским управлением по пестицидам и ветеринарным лекарствам (APVMA).Однако эта ситуация изменилась 8 ^-го октября 2019 года, когда вступили в силу утвержденные поправки к Регламенту по генным технологиям 2001 . Технический обзор Регламента по генным технологиям 2001 OGTR разъясняет нормативный статус организмов, созданных с использованием ряда новых технологий, и гарантирует, что регулирование новых технологий соизмеримо с риском, который они представляют. В случае РНК-индуцированных пестицидов, подавляющих гены, новое положение разъясняет, что методы, включающие нанесение РНК на организм для временной индукции РНКи, не составляют генную технологию при условии, что РНК не может быть транслирована в полипептид, геномную последовательность организма. не может быть изменен в результате, и инфекционный агент не может быть произведен.

При выполнении этих условий полученные организмы не являются ГМО для целей Закона о генных технологиях 2000 . Таким образом, методы РНКи, которые включают непосредственное нанесение РНК на растения для временной индукции РНКи, не подлежат регулированию со стороны OGTR с 8 ^-го октября 2019 года.

APVMA продолжит обеспечивать регулирующий надзор за местно применяемыми продуктами на основе РНКи в Австралия. В соответствии с Законом о Кодексе сельскохозяйственных и ветеринарных химикатов от 1994 года , продукты на основе дцРНК, применяемые местно для защиты растений от насекомых, грибковых и вирусных вредителей, определяются как сельскохозяйственные химические продукты.Пакеты данных в поддержку регистрации новых сельскохозяйственных химических продуктов касаются, как минимум, химии и производства, здоровья человека, здоровья и безопасности рабочих, экологической судьбы и токсичности, эффективности и безопасности сельскохозяйственных культур, а также торговли за рубежом. Представленные данные для каждой из этих областей должны быть достаточно качественными, чтобы на них можно было полагаться при принятии регулирующих решений. Чтобы APVMA выдало одобрение или регистрацию, APVMA должна убедиться в том, что критерии безопасности, торговли и эффективности, относящиеся к конкретному активному компоненту или продукту, соблюдены.В настоящее время отсутствуют конкретные руководящие принципы относительно типов информации, которая может быть представлена ​​для удовлетворения этих критериев для продуктов на основе РНКи, применяемых местно; однако APVMA предоставляет потенциальным кандидатам помощь перед подачей заявки, и эта услуга неоценима для новых технологий, таких как пестициды, подавляющие гены с помощью РНК.

Заключение

Потенциальные преимущества применения местной РНКи в качестве меры защиты растений многочисленны, включая низкую токсичность по сравнению со многими существующими пестицидами, видоспецифичность и номинальное воздействие на окружающую среду при соответствующем дизайне дцРНК.Однако реализация многих из этих преимуществ зависит от разработки механизмов доставки, занимающих столь же мало места. Как и в случае с любой новой технологией, существуют определенные риски, которых следует избегать в первом случае и снижать во втором. Предполагаемые непредвиденные последствия в первую очередь связаны с воздействием на здоровье человека и окружающую среду. Учитывая множественные и повторяющиеся препятствия на пути поглощения дцРНК человеком, маловероятно, что значительные вредные воздействия станут очевидными при воздействии.Способность дцРНК быстро разлагаться в окружающей среде, по-видимому, ограничивает ее воздействие на организмы, не являющиеся мишенями, как в момент нанесения, так и после нанесения. Виды, близкие к целевым видам, с наибольшей вероятностью пострадают из-за их генетического сходства и вероятной восприимчивости к РНКи окружающей среды, если они присутствуют в непосредственной близости от места применения. Основанный на биоинформатике дизайн последовательностей дцРНК для минимизации гомологии с эндогенными транскриптами как в растении-хозяине, так и в NTO является важным подходом к предотвращению и снижению рисков.Однако ограничения этого подхода требуют, чтобы он был частью набора инструментов, которые помогают смягчить любые непредвиденные последствия воздействия на окружающую среду. Если зачатие и разработка проводятся осторожно и строго, продукты на основе РНКи способны произвести революцию в борьбе с вредителями и патогенами безопасным и эффективным способом.

Вклад авторов

Рукопись написали SF, PR и NM. Фигуры разработали BH и SF. Все авторы внесли свой вклад в концепцию, редактирование, редактирование и утверждение рукописи.

Финансирование

Этот доклад был представлен на конференции ОЭСР по регулированию применяемых извне продуктов на основе дцРНК для борьбы с вредителями, которая проходила в ОЭСР в Париже, Франция, 10–12 апреля 2019 г. и спонсировалась Программа совместных исследований ОЭСР: Управление биологическими ресурсами для устойчивых сельскохозяйственных систем, финансовая поддержка которой позволила НМ принять участие в семинаре.

SF финансируется за счет гранта Hort Innovation, соинвесторами которого являются Корпорация исследований и развития хлопка и Nufarm Australia (VG16037).BH финансируется за счет стипендии Университета Квинсленда.

Заявление об ограничении ответственности

Мнения и аргументы, использованные в этом документе, являются исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражают точку зрения ОЭСР или правительств ее стран-членов.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Список литературы