Табак ксанти описание: Купить табак сорт Ксанти, лапша 1 кг, на вес для самокруток

Даже с огромной натяжкой нельзя назвать табак полезным для человеческого организма, но вредная привычка табакокурения напрочь связала руки, чуть ли не каждому пятому современному человеку

Мало кто обращает внимание, о чем неоднократно предупреждает Минздрав. Поэтому выращивание табака всегда есть и будет актуальным и прибыльным делом для предприятий по изготовлению табачных изделий. Хотя доля пользы от этого растения все же присутствует — из табачного стебля извлекают никотиновую кислоту, которая используется в медицине; а также табак, размещенный в шкафах, является прекрасным отпугивателем моли, шашеля, на грядках приусадебных участков табак выращивают рядом с овощами для защиты от мелких грызунов и вредоносных насекомых.

История табака

Европа узнала об этом растении после экспедиции Колумба на остров Куба. В 1492 году мореплаватели сошли на берег острова и увидели местных жителей, держащих во рту какие-то трубочки и выпускающих дым из ноздрей. Исследователи новых земель чрезвычайно заинтересовались этим занятием, а один из моряков даже рискнул попробовать покурить вместе с аборигенами. Курение ему понравилось, и перед возвращением на родные земли команда взяла с собой сухие листья этого растения. По возвращению домой испанской экспедиции не терпелось познакомить народ с новшеством. Но в то время в Европе во всю бушевала инквизиция, которая сочла процесс курения происками дьявола. Человек, заявивший о табаке, угодил в тюрьму. Пожалуй, это оказалось самой первой карой за курение в Европе. Причем довольно строгой — Родриго де Херес провел в заточении около 7 лет. Однако табак, равно как и его использование, начал распространятся среди населения, постепенно охватывая все страны Европы.

Вопреки распространенному мнению Колумб не завозил семена табака — его заслуга состоит лишь в описании процесса курения аборигенами Америки и доставкой первых табачных листьев. Семена же растения были завезены позже.
После того, как по рекомендации дипломата Жана Нико нюхательный табак помог Екатерине Медичи избавиться от мигрени, выращивание и употребление табака приобрело значительно большие масштабы. Именно Жан Вильман Нико стал одним из главных приверженцев табака и популяризатором его в Европе. Убежденный в целебных свойствах необычной травы, Нико создал довольно объемный труд, содержащий перечень болезней, от которых можно избавиться с помощью табака. Среди многих недугов там были перечислены:

• насморк;
• колики;
• язвы;
• зубная боль;
• истерия и прочее.

Как бы там ни было, Нико себя увековечил — постепенно за табаком закрепилось название «никотиновая трава», а открытый длительное время спустя основной алкалоид табака был назван «никотином».

Интересным историческим фактом является то, что примерно до середины XVII века с употреблением табака практически повсеместно боролись и власти и церковь.
Италия, 1624 год. Папа Урбан VIII издает указ об отлучении от церкви курящих и нюхающих табак в святых местах.
Англия, 1618 год. Король ЯковI издает «Протест табаку», в котором говорится о вреде употребления этого растения.

Турция, 1647 год. Табак ставят на один уровень с запрещенными для правоверных вином и опиумом. Наказанием за нарушение запрета является смерть.
Иран, примерно 1640 год. Шах Сефи приказал залить купцам, пойманным на продаже табака, расплавленный свинец в горло.
Китай, 1638–1641 годы. Император Мин принимает законы о запрете курения и торговли табаком.

На территорию нынешней России табак, опять-таки вопреки распространенному мнению, попал не во времена Петра Великого, а значительно раньше — в годы правления Ивана IV Васильевича (Грозного). Причем известна достаточно точная дата начала шествия табака по Руси. В 1553 году английский корабль, сбившийся с курса из-за бури в Белом море, пристал к берегам новой для англичан страны, оказавшейся Россией или Московией. Именно с этого времени и начинаются торговые отношения России и Англии, в результате которых на территорию страны попадает вначале сам табак, а позже и его семена.

А вот Петр I, ставший впоследствии главным виновником широкого распространенния курения в России, изначально был против вредного по его мнению занятия. При нем существовали меры наказания за курения табака — от штрафов, до битья кнутом и ссылки. И лишь после своей знаменитой поездки в Европу вследствие появившейся привычки к курению царь коренным образом меняет свои взгляды на табак. Кстати при нем же была создана первая плантация табака (на территории современной Украины), однако отечественный табак не пользовался большим спросом и дело понемногу затихло.

В полном соответствии с поговоркой «Кому война, а кому мать родна», можно с полной уверенностью сказать, что основным толчком в развитии табачной промышленности явились именно войны — первая и вторая мировая. Здесь все достачно просто — в паек солдата помимо продуктов питания входили табачные изделия — сам табак, сигареты, сигары — в зависимости от страны. Как результат — огромное количество пристрастившихся к курению людей. Кроме того, распространению курения способствовал и голод, поскольку содержащиеся в табаке вещества способны чувство голода притуплять, а также оказывать кратковременное тонизирующее воздействие на организм.
Учеными подмечено, что привычка к курению распространена в стране тем больше, чем ниже она находится на социально-экономической лестнице в мире.
На сегодняшний день табачными предприятиями выращивается множество сортов табака для изготовления табачных изделий, вот только некоторые из них:

• Вирджиния;
• Турецкий;
• Махорка обыкновенная;
• Ксанти;
• Тернопольский 14;
• Измир.

Сигары и курительный табак делают из сортов Гавана 2000, ВМС, Пергей, Бравый 200, Гавана Голд, Криолло 98, Вуэльто Абахо.

Процесс выращивания табака из семян

Выращивание табака начинается с высева семян в ячейки или ящики. В открытый грунт сажать семена запрещено, так как они обладают низкой всхожестью и склонностью к отставанию в росте и заболеваниям. Перед посевом табачные семена на сутки замачивают в 0,01% винном уксусе или растворе формалина, что повышает их всхожесть и устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды. После этого можно применить метод проращивания во влажной среде (поместив семена в небольшое количество воды и накрыв тканью) или сразу высадить в землю. Глубина посева семян в емкости не должна превышать 10–15 мм. При температуре +26…+28°С семена прорастут уже через четверо суток.

Высадка в открытый грунт осуществится через 30–50 дней, когда на стебле будет 5–7 настоящих листьев. В этот отрезок времени проводится подкормка растений минеральными удобрениями и обильный полив. За неделю до высадки рассады в открытый грунт полив прекращают.

Выращивание табака на открытом грунте

Выращивание табака больше приветствуется в южных регионах страны, ведь это теплолюбивое растение, поэтому рассаду высаживают в грунт в марте—апреле, а при условиях затяжной холодной весны и вовсе в начале мая. Почва под табак подвергается ранней зяблевой вспашке на глубину 25 см. Раз в несколько лет поле вспахивают на глубину 50 см, это помогает предостеречь появление заразихи (сорнякового растения-паразита).

Весной, до высадки рассады, почву 2–3 раза культивируют или применяют неглубокую обработку лущильниками. Важно качественно очистить поле от предшественников и сорняков, чтобы избежать заражения растений болезнетворными микроорганизмами, которые, как известно, находятся в гниющих в земле корнях и стеблях. Кроме этого, нужно правильно подбирать предшественников для выращивания табака, наилучшими из которых являются озимые хлеба, злаковые культуры, сахарная свекла, многолетние травы. Нельзя сажать табак после подсолнечника, пасленовых, а также сеять табак повторно на одном и том же месте.

Табак хорошо высасывает из почвы все питательные вещества, поэтому недостаток того или иного минерала в составе грунта отрицательно сказывается на темпе роста, способностью противостоять заболеваниям и вредителям. Кроме минеральных добавок, в грунт вносят перегной или птичий помет. Приблизительный расход удобрений на 1 гектар:

• 10–25 т органических;
• 10–55 кг фосфорных;
• 5–50 кг калийных;
• 15–25 кг азотных.

Рассаду сажают в грунт рассадопосадочными машинами. Необходимая температура верхнего слоя грунта при этом +10…+12°С. В зависимости от особенностей выращиваемого сорта рассчитывается густота стояния, обычно это 44–48 тысяч штук на 1 гектар. Способ посадки — обычный рядовой, ширина междурядий — 60–70 см, расстояние между растениями — 20–25 см.

Уход за рассадой табака

Данные мероприятия нельзя назвать очень сложным. За весь период выращивания в районах искусственного орошения полей применяют от двух до шести поливов. С началом цветения расход воды при поливе сокращают. Также рассада нуждается в неоднократных периодических междурядных обработках, первая из них происходит уже через 10–15 дней после высадки. Табак необходимо окучить, чтобы корневая система развивалась лучше, а стебель рос потолще. При выращивании табака необходимо выполнять вершкование и пасынкование. Во время вершкования удаляют верхние цветы и лишние листья, также и самые нижние листья, а при пасынковании — боковые побеги. Благодаря этому питательные вещества концентрируются в основных ярусах, что повышает качество сырья и урожайность.

Табак, несмотря на свою горечь и кажущеюся неприступность, тоже подвергается заболеваниям и атакам вредителей, таких как:

• персиковая тля;
• мучнистая роса;
• мозаика;
• черная ножка;
• рябуха бактериальная;
• корневая черная гниль.

Меры борьбы с данной проблемой — обеззараживание посевного материала и инвентаря формалином, корректировка поливного режима, правильный подбор предшественников, обработка препаратом Фундазол, суспензией поликарбацина, бордоской жидкостью, полив раствором медного купороса.

Сбор и обработка табака

Когда листья табака начали покрываться смолянистым налетом, приобрели светлую окраску и хрупкость — наступила фаза технической спелости. Именно в это период надо приступать к сбору урожая. Уборка проходит в несколько приемов, по мере созревания листьев. Сбор проходит вручную, в утреннее или вечернее время, когда нет росы. После сбора листьев они подвергаются немедленной сушке в предназначенных для таких целей, помещениях. Сушка может проводиться двумя способами: фиксацией и томлением. При первом способе сушение проходит на солнце или в огневых сушилках (t +40…+50°С), а при втором в специально оборудованных сараях (t +25…+30°С и влажность 75–85%). После сушки проходит сортировка и упаковка, потом сырье доставляют в заготовительный пункт.
Табачный дым содержит в себе более 4000 компонентов, способных вызывать мутации клеток, изменять структуру крови, способствовать накапливанию в организме целого букета опасных веществ, таких как:

• аммиак;
• полоний;
• ацетон;
• метиловый спирт;
• бензол;
• мышьяк и прочих.

Но, как показывает практика, сколько курильщику не объясняй о вреде курения, он всё равно будет помнить о пачке сигарет, которая лежит у него в кармане, и вряд ли выбросит её в урну после нравоучительной лекции. Курить или не курить — дело сознательного выбора каждого, от данной вредной привычки отказаться достаточно нелегко. Поэтому табачная промышленность — довольно прибыльное дело.

Выращивание растения табак — разведение рассады, правила ухода, сборки и обработки урожая.

Растение табак принадлежит к семейству Пасленовые, потому выращивание не сильно отличается от других культур, что к нему относятся. В листьях растения содержится вещество под названием никотин. Оно обладает способностью подавлять ощущение голода и разжижать кровь, уменьшая ее свертываемость.

Попадание никотина в организм человека ведет к частичной деминерализации его систем, а также способствует развитию стойкого привыкания. Поговорим подробнее о выращивании такого растения как табак.

Описание растения

Свое латинское наименование (в транскрипции кириллицей «никотиана») табак получил в честь французского посла Ж. Нико, находившегося на государственной службе в Португалии. Ученый К. Линней при описании растения употребил это же название.

Прекрасное растение — табак

В соответствии с Международным Кодексом ботанической номенклатуры названия видов растений, которые были известны до 1 мая 1753 г., начиная с этой даты, перестали считаться действительными.

Поэтому К. Линнея принято называть автором названия рода Табак.

Вплоть до 16 в. табак был известен только индейцам Южной и Северной Америки. В 1556 г. путешественник А. Теве привез семена к себе на родину, во Францию.

В начале растение выращивалось как декоративное украшение. Вскоре открылось, что из листьев табака можно делать нюхательные составы, а затем и курительные.

К началу 17 в. в испанских колониях на североамериканском материке появились первые плантации табака, выращиваемого на продажу.

Первый урожай был собран в штате Вирджиния и в соответствии с местом получил название виргинского. Через несколько лет виргинский табак вошел в число лидеров местного экспорта и даже стал использоваться в качестве валюты обмена.

Род этого растения образуют около 75 видов. Каждый взрослый экземпляр имеет длинный стержневой корень и разветвленный стебель. На стебле растут крупные цельные листья, сидячие или на черешках.

После того, как растение отцветает, в его завязи образуется плод – коробочка со множеством семян, которая растрескивается, полностью созрев. Семена табака имеют овальную форму и темно-коричневую окраску, обладают высокой всхожестью.

В качестве наполнителя для сигарет, папирос и др. используется всего два вида табака: обыкновенный и деревенский (махорка). Эти виды дали начало множеству существующих сортов.

Соцветия табака (фото)

Для наполнения сигарет и набивки трубок наиболее подходящими являются сорта:

• Кентукки Берли;
• Тернопольский;
• Турецкий;
• Ксанти;
• Вирджиния Голд;
• Измир.

Для наполнения сигар используют сорта:

• Гавана 142;
• Гавана 2000;
• Вуэльто Абахо;
• Циммер Спэниш;
• Пенсильвания Ред.

Также как и среди других культурных растений, сорта табака делят на ранние, средние и поздние.

Выращивание и высадка рассады растения табак

Выращивание растения табак начинается с посева семян под рассаду. Табачные семена очень мелкие. Для того чтобы аккуратно провести посев, их смешивают с влажным чистым песком. В контейнер для высадки насыпают дренажный слой, затем легкий питательный грунт. Выкладываются слоем песок с семенами.

Сверху присыпают грунтом на 0, 2-0,3 сантиметра. Грунт перед посевом семян надо хорошо увлажнить.

Посев семян под рассаду можно начинать с первых дней февраля. Контейнер накрывают полиэтиленовой пленкой, стеклом или пластиковой крышкой и помещают в теплую среду. Оптимальная температура воздуха для проращивания составляет 22-24ºС.

На появление первых ростков уходит от одной до двух недель. За это время лучше не поливать проращиваемые семена, так как высока вероятность их повреждения. Как только появятся первые ростки, контейнер можно освободить от укрывного материала и поставить на окно, где не будет сквозняка.

Подготовка почвы для посадки табака

Сеянцы очень хрупкие и нежные. Увлажнять почву под ними лучше из пульверизатора.  Нельзя допускать вытягивание ростков в высоту.

После того как на ростках появится несколько настоящих листков, проводят пикировку – сеянцы рассаживают в отдельные небольшие контейнеры, прищипывая при этом центральный корешок. После пикировки и до высадки в открытый грунт сеянцы необходимо поливать – не очень часто, но так, чтобы земля не пересыхала.

Рассада набирается достаточно сил только через 4 – 4,5 месяца спустя высева семян. Высадка производится после того как на сеянцах появится 5-6 настоящих листьев. Воздух и почва должны достаточно прогреться. Высадка рассады табака в открытый грунт осуществляется после того как минует угроза ночных заморозков.

Мнение эксперта

Юлия Юрьевна

Имею большой сад и огород, несколько теплиц. Люблю современные методики культивирования растений и мульчирования почвы, делюсь опытом.

Рассада растения табак, так же как и другие культуры, подвергается заболеваниям в процессе выращивания. Чтоб избежать этого, стоит использовать только продезинфицированный грунт. Перед высаживанием субстрат можно полить кипятком или раствором фунгицида.

Более надежный способ обеззараживания — прокаливание в духовке. Но, сразу после процедуры использовать землю нельзя. В ней должна восстановиться полезная микрофлора. Для этого требуется 1,5-2 недели.

Во время выращивания рассады нужно хотя-бы раз полить ее противогрибковым препаратом. Лучше выбирать такое средство, что содержит витаминные добавки. После пикировки также рекомендуем полить табак слабым раствором фунгицида. Это предотвратит заболевания поврежденной корневой системы.

Вместо препаратов можно использовать раствор марганца, борной кислоты или золы. Но, такие средства подходят именно для профилактики.

Сеянцы высаживаются в шахматном порядке. Между растениями в ряду оставляют расстояние 70 см, между рядами – 100 см, так как взрослые кусты табака – очень раскидистые.

Табачные кусты нуждаются в обильном поливе. Его необходимо проводить каждый день или через день.

На каждое растение требуется 5 л воды. После того как кусты достигнут высот 1 м, объем полива надо увеличить до 10 л за один раз.

Спустя некоторое время после полива, когда почва вокруг кустов немного просохнет, производят рыхление. Эту процедуру нужно проводить один-два раза в неделю.

Подкормки табака проводятся три раза за сезон – сразу после высадки рассады в открытый грунт, затем спустя 2 и еще через 2 недели. В качестве подкормки используют комплексные минеральные удобрения.

Табак подвержен нашествиям насекомых-вредителей. Его зеленью охотно «займутся»:

• медведка;
• табачные трипсы;
• тля;
• полевые слизни и др.

Именно с такого куста можно собирать листики (фото)

С каждым из вредителей борются по-разному. Чтобы предупредить появление медведки, почву перед посадкой рассады просыпают гексахлораном. Если вредитель все-таки появился, в земле оставляют отравленные приманки.

Борьба с табачными трипсами включает опрыскивание кустов табака суспензией формалина. Против полевых слизней используются такие средства, как медный купорос и гашеная известь.

Кусты табака растут практически до первых заморозков. Поздние сорта в условиях северных широт могут цвести до середины октября.

Мнение эксперта

Юлия Юрьевна

Имею большой сад и огород, несколько теплиц. Люблю современные методики культивирования растений и мульчирования почвы, делюсь опытом.

Если планируется выращивать большое количество растений табака, рекомендуем подготовить грядки заранее. Поскольку такой культуре требуется большое количество воды, можно использовать капельное орошение.

Для защиты от медведки можно вкапывать приманки по периметру грядки. Можно использовать отваренное зерно, в которое добавлен инсектицид. В смесь также стоит вмешать растительное масло. Это повысит привлекательность приманки для вредителя и замаскирует запах препарата.

Для борьбы со слизнями также стоит использовать приманки. Одних препаратов в борьбе с этими моллюсками не достаточно из-за стремительного размножения.

Чтоб собрать в одном месте как можно больше слизней нужно взять деревянную доску, смазать ее чем-то кисло-сладким, например, испорченным фруктом и расположить в тенистом месте сада. Собравшихся там вредителей уничтожают механически.

Нюансы разведения табака

В тех случаях, когда табак выращивают для получения набивного материала в сигареты, у начинающего цвести растения необходимо удалить все цветки и выломать пасынки – боковые побеги. Эта процедура стимулирует рост листьев, ради которых и выращивается растение.

Табачные листья зреют постепенно – от нижних к верхним. Поэтому при сборке урожая первыми обрывают листья, растущие в нижней части стебля.

Через несколько дней обрываются средние листья, еще через некоторое время – верхние. Они имеют наибольшую сочность. Сбор листьев с одного растения может растянуться на целый месяц.

Каждый уровень листьев имеет свое название и ценность. Нетрудно догадаться, что верхние листья – наиболее ценное сырье.

Табак, предназначенный для изготовления верхней оболочки сигар, выращивают в притененных местах.

Выращивание табака в поле

Благодаря отсутствию солнца листья такого табака становятся особенно нежными.

Табак, листья которого пойдут в «начинку» сигарет и сигар, выращивается на открытой местности.

Кроме того, что у кустов табака нужно обрывать цветки и проводить пасынкование, у них также стоит удалять верхние почки.

Это позволит ускорить развитие листьев, так как они будут поглощать питательные вещества, предназначенные для поддержки всего растения.

В условиях промышленного разведения табака на тех растениях, сбор урожая с которых планируется осуществить в следующем сезоне, соцветия не обрываются.

Эти кусты растут под особым наблюдением специалистов и представляют собой особую ценность как сырьевой материал.

Во время просмотра видео вы узнаете о выращивании табака.

Кроме того, что табак выращивают для получения курительных смесей, его также можно использовать на своем приусадебном участке как декоративное растение. 

Кусты табака вырастают до 3 м в высоту. Цветут они очень обильно, бледно-розовыми цветками. Учитывая то, что цветение проходит осенью, когда других цветущих растений остается не так уж много, кусты табака будут притягивать к себе внимание прохожих и радовать взгляд хозяев приусадебного участка.

Заметили ошибку? Выделите ее и нажмите Ctrl+Enter, чтобы сообщить нам.

Это меня удивило

Сад и Огород

Системы производства биомассы для трансгенных табачных изделий

ВЛИЯНИЕ АЦИБЕНЗОЛАР-S-МЕТИЛА И СМЕСИ ВИДОВ БАЦИЛЛОВ НА РОСТ И ЭНЕРГИЮ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ТАБАКОВ

SAR и ISR — это 2 типа механизмов индуцированной резистентности в табаке и других растительных системах 16.В естественных условиях некротические патогенные организмы вызывают SAR, а непатогенные ризобактерии активируют ISR. Оба типа устойчивости эффективны против широкого круга патогенов 16. SAR и ISR фенотипически похожи, но механически различны. Было продемонстрировано, что, как и SAR, ISR системно действует против грибков, бактерий и вирусов арабидопсиса, фасоли ( Phaseolus vulgaris L.), гвоздики ( Dianthus caryophyllus L.), огурца ( Cucumis sativus L.), редис ( Raphanus sativus L.), табак и томат 8,18. Как SAR, так и ISR пути модулируются NPR1 , общим ключевым регуляторным белком. Сообщается, что ацибензолар- S -метил (ASM), структурный аналог салициловой кислоты, индуцирует SAR у нескольких сельскохозяйственных культур, включая табак ( Nicotiana tabacum L.) 6. Конкретные штаммы ризобактерий, способствующих росту растений ( PGPR), как было показано, вызывают ISR у различных культур, включая табак, в тепличных и полевых условиях 8.Было показано, что ISR снижает частоту и тяжесть заболеваний, вызываемых грибами, бактериями и вирусами на различных культурах 19. Было продемонстрировано, что помимо защиты от болезней, PGPR улучшает рост растений за счет изменения ультраструктурной цитохимии, например, увеличения продукции гормонов растений. 3,8.

SAR с помощью ASM эффективна против вируса пятнистого увядания томатов (TSWV) на табаке, особенно в сочетании с инсектицидом имидаклопридом 6,12,13.Было продемонстрировано, что ASM действует, влияя на репликацию и движение вируса 10,12,13. Также было показано, что ASM контролирует грибковые пятна на листьях табака, такие как синяя плесень ( Peronospora tabacina ), мороженный глаз ( Cercospora nicotianae ) и целевое пятно ( Thanatephorus cucumeris ) 5,7,9, а также лесные пожары. и угловатая пятнистость на листьях табака, вызванная Pseudomonas syringae 5. Фитотоксические симптомы, вызванные ASM, нежелательны для табака, даже если достигается значительная защита от болезней.Табак дымовой сушки, обработанный 1000 мг активного вещества. на 7000 растений ASM снижает рост корней в тепличных условиях 6. Нормы внесения 4000 и 15000 мг ASM / акр максимизируют индукцию устойчивости табака к болезням против бактериальных и грибковых пятен на листьях и к TSWV, но вызывают фитотоксичность от легкой до тяжелой, в основном некроз листьев и задержка роста растений 5,10. Напротив, на древесных декоративных растениях яблони фитотоксичность не наблюдалась [ Malus domestica (Borkh.) Borkh.], спаржа ( Asparagus officinalis L.) и болгарский перец ( Capsicum annuum L.) 1,4,11. Комбинирование гибберелловой кислоты с АСМ в дозе 1000–2000 мг д.в. на 7000 табачных растений в тепличных условиях снижает фитотоксичность и повышает SAR 10. В рамках нашего исследования, посвященного изучению возможных различий в индукции устойчивости между различными типами табака и оценке SAR как потенциальной стратегии борьбы с нематодами табачных цист ( Globodera tabacum solanacearum ) на табаке восточной и дымовой сушки 15 мы стремились оценить влияние концентрации ASM и способа доставки на возможные фитотоксические эффекты.Также оценивались возможные положительные эффекты комбинации A13 + IN937a с ASM на фитотоксичность.

Влияние двух штаммов вируса табачной мозаики на фотосинтетические характеристики и распределение азота в листьях Nicotiana tabacum cv Xanthi во время фотоакклимации при двух режимах азотного питания

TY — JOUR

T1 — Влияние двух штаммов вируса табачной мозаики на фотосинтетические характеристики и Разделение азота в листьях Nicotiana tabacum cv Xanthi во время фотоакклимации при двух режимах азотного питания

AU — Balachandran, Suchandra

AU — Osmond, C.Barry

AU — Makino, Amane

PY — 1994/3

Y1 — 1994/3

N2 — Фотоакклимация была изучена на листьях табака (Nicotiana tabacum cv Xanthi), инфицированных двумя штаммами вируса табачной мозаики (TMV) и выращивается при разных режимах светового и азотного питания. Фотосинтетическая акклиматизация, измеряемая по квантовому выходу и максимальной скорости насыщенного света фотосинтеза, насыщенного CO2, была нарушена в большей степени у листьев табака, инфицированных штаммом PV230 TMV, чем у листьев, инфицированных штаммом PV42 TMV.Заражение штаммом ВТМ PV230 серьезно нарушает фотосинтетическую акклиматизацию при высоком освещении / низком уровне азота и во время перехода от низкого к яркому свету. Расширяющиеся листья с симптомами хлоротикмозаики имели значительно меньшую способность адаптироваться к яркому свету по сравнению с контрольными сортами и с развитыми листьями без видимых симптомов. Мы пришли к выводу, что неспособность к акклиматизации разрастающихся листьев в значительной степени была вызвана разрушением хлоропластов в желтых участках ткани, сопровождающимся резким снижением уровней рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы / оксигеназы и соответствующим снижением фотосинтеза на листе. -площадь основы.После поправки на участки здоровой зеленой ткани фотоакклимация инфицированных листьев была такой же, как и у контрольных растений. Видимое развитие симптомов было наибольшим при лечении с высоким освещением / низким содержанием азота. В развитых листьях без видимых симптомов накопление вирусов, которое было таким же обширным, как и в разрастающихся листьях, ускоренное старение и нарушение фотоакклимации во время перехода от слабого освещения к яркому. Как правило, инфицирование штаммом PV42 TMV не нарушало фотосинтетической акклиматизации и даже усиливало ее при некоторых обработках, даже несмотря на то, что вирус накапливался до той же концентрации, что и в листьях, инфицированных PV230.Эти данные показывают, что TMV не просто ухудшает фотоакклимацию табака, конкурируя с хлоропластами за запасы азота в листьях. Скорее, специфические свойства тяжелых штаммов, таких как PV230, которые приводят к появлению видимых симптомов и частичной потере фотосинтетической активности в расширяющихся листьях, а также к общему ускорению старения хлоропластов в развитых листьях, способствуют нарушению фотоакклимации, которое обычно усугубляется низкой азотное питание.

AB — Фотоаклимация была изучена на листьях табака (Nicotiana tabacum cv Xanthi), инфицированных двумя штаммами вируса табачной мозаики (TMV) и выращенных при различных режимах светового и азотного питания.Фотосинтетическая акклиматизация, измеряемая по квантовому выходу и максимальной скорости насыщенного света фотосинтеза, насыщенного CO2, была нарушена в большей степени у листьев табака, инфицированных штаммом PV230 TMV, чем у листьев, инфицированных штаммом PV42 TMV. Заражение штаммом ВТМ PV230 серьезно нарушает фотосинтетическую акклиматизацию при высоком освещении / низком уровне азота и во время перехода от низкого к яркому свету. Расширяющиеся листья с симптомами хлоротикмозаики имели значительно меньшую способность адаптироваться к яркому свету по сравнению с контрольными сортами и с развитыми листьями без видимых симптомов.Мы пришли к выводу, что неспособность к акклиматизации разрастающихся листьев в значительной степени была вызвана разрушением хлоропластов в желтых участках ткани, сопровождающимся резким снижением уровней рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы / оксигеназы и соответствующим снижением фотосинтеза на листе. -площадь основы. После поправки на участки здоровой зеленой ткани фотоакклимация инфицированных листьев была такой же, как и у контрольных растений. Видимое развитие симптомов было наибольшим при лечении с высоким освещением / низким содержанием азота.В развитых листьях без видимых симптомов накопление вирусов, которое было таким же обширным, как и в разрастающихся листьях, ускоренное старение и нарушение фотоакклимации во время перехода от слабого освещения к яркому. Как правило, инфицирование штаммом PV42 TMV не нарушало фотосинтетической акклиматизации и даже усиливало ее при некоторых обработках, даже несмотря на то, что вирус накапливался до той же концентрации, что и в листьях, инфицированных PV230. Эти данные показывают, что TMV не просто ухудшает фотоакклимацию табака, конкурируя с хлоропластами за запасы азота в листьях.Скорее, специфические свойства тяжелых штаммов, таких как PV230, которые приводят к появлению видимых симптомов и частичной потере фотосинтетической активности в расширяющихся листьях, а также к общему ускорению старения хлоропластов в развитых листьях, способствуют нарушению фотоакклимации, которое обычно усугубляется низкой азотное питание.

UR — http://www.scopus.com/inward/record.url?scp=0028066381&partnerID=8YFLogxK

UR — http://www.scopus.com/inward/citedby.url?scp=0028066381&partnerIDxKFLog

У2 — 10.1104 / pp.104.3.1043

DO — 10.1104 / pp.104.3.1043

M3 — Артикул

AN — SCOPUS: 0028066381

VL — 104

SP — 1043

EP — 1050

JO — Завод Физиология

JF — Физиология растений

SN — 0032-0889

IS — 3

ER —

Противовирусная активность глюкозилцерамидов, выделенных из Fusarium oxysporum, против инфекции вирусом табачной мозаики

Abstract

Природные элиситоры, полученные из патогенных микроорганизмов, представляют собой экологическую стратегию достижения устойчивости растений к болезням.Глюкозилцерамиды (GlcCer) классифицируются как нейтральные гликосфинголипиды. GlcCer выделяли и очищали из мицелия Fusarium oxysporum . Ф . oxysporum — это патогенный гриб для растений, распространенный в почве и вызывающий серьезные потери таких экономически важных культур, как кукуруза, табак, банан, хлопок и маракуйя. В этом исследовании мы оцениваем способность GlcCer вызывать устойчивость у N . tabacum cv Xanthi растений против вируса табачной мозаики (TMV).Опрыскивание растений табака GlcCer до заражения вирусом снижает частоту некротических поражений, вызванных TMV. Кроме того, растения, уже инфицированные вирусом, показали снижение поражений гиперчувствительного ответа (HR) после обработки GlcCer, что свидетельствует о противовирусном эффекте GlcCer. Наши исследования показали, что GlcCer стимулирует раннее накопление H ₂ O ₂ и супероксидных радикалов. Кроме того, экспрессия PR-1 (связанный с патогенезом 1, с предполагаемым противогрибковым действием), PR-2 (β-1,3-глюканаза), PR-3 (хитиназа), PR-5 (осмотин), PAL ( Гены фенилаланинаммиаклиазы, LOX (липоксигеназы) и POX (пероксидазы) сильно индуцировались после обработки растений табака GlcCer, и уровни индукции оставались высокими в течение периода от 6 до 120 часов.Наши эксперименты демонстрируют, что GlcCer индуцирует устойчивость растений табака к инфекции TMV.

Образец цитирования: Bernardino MC, Couto MLCO, Vaslin MFS, Barreto-Bergter E (2020) Противовирусная активность глюкозилцерамидов, выделенных из Fusarium oxysporum , против инфекции Tobacco mosaic viru s. PLoS ONE 15 (11): e0242887. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0242887

Редактор: Габриэль Агбор, Институт медицинских исследований и изучения лекарственных растений, КАМЕРОН

Поступила: 21 июля 2020 г .; Одобрена: 10 ноября 2020 г .; Опубликовано: 25 ноября 2020 г.

Авторские права: © 2020 Bernardino et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в рукописи и ее S1_raw_images.

Финансирование: Автор (ы) не получил специального финансирования для этой работы.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Род Fusarium широко распространен в мире и встречается как в умеренных, так и в тропических регионах [1]. Fusarium oxysporum — это фитопатогенный гриб, который широко распространен в почве и вызывает значительные экономические потери при выращивании таких культур, как кукуруза, банан, хлопок и маракуйя. Виды, относящиеся к F . Комплекс oxysporum (FOSC) может поражать широкий спектр растений, включая однолетние и многолетние двудольные и однодольные [2, 3].Полевые потери, связанные с FOSC, имеют большое влияние и занимают 5-е место в списке 10 основных патогенов растений, имеющих научное / экономическое значение [4].

Цереброзиды или моногексозилцерамиды (CMH) представляют собой нейтральные гликосфинголипиды, которые содержат моносахарид, обычно глюкозу или галактозу, в 1-орто-бетагликозидной связи с церамидом. Исследования показывают, что цереброзиды способны придавать устойчивость корням пшеницы к повреждениям, вызванным холодом, путем модуляции липидного состава плазматической мембраны [5].Кроме того, Умемура и др. . [6] и Naveen et al . [7] также сообщают, что цереброзид Fusarium является важным элиситором, поскольку он придает устойчивость нескольким видам растений, пораженным фузариозом. Несмотря на важные открытия, сделанные обеими группами, до сих пор существует мало публикаций, исследующих роль цереброзида как элиситора, и ни одна из них не сообщает о противовирусном эффекте, связанном с его выявлением.

Системная приобретенная резистентность, известная как SAR, представляет собой длительную защиту широкого спектра действия, при которой инфекция патогеном в первичной локализации может вызвать защиту дистальных отделов тканей от различных типов патогенов.Индуцибельные защитные механизмы, которые активируются при атаке патогена, включают укрепление клеточной стенки, включающее отложение каллозы, образование активных форм кислорода (АФК), накопление таких вторичных метаболитов, как фенольные соединения, и производство так называемых, связанных с патогенезом ( PR) белки [8]. Реймер-Михальски и Конрат [9] сообщают, что SAR — это большие перспективы для устойчивого сельского хозяйства, поскольку иммунные реакции растений имеют широкий спектр активности, длящийся в течение нескольких дней или месяцев, и не оказывают значительного влияния на приспособленность растений.

Вирус табачной мозаики (TMV), печально известный патоген, вызвавший серьезные экономические потери во всем мире, имеет широкий спектр хозяев, состоящий из более чем 885 видов растений, принадлежащих к 65 семействам [10]. Растения, инфицированные TMV, могут иметь мозаику или пятнистость на листьях, некроз, задержку роста, скручивание листьев и пожелтение тканей растений. Задержка роста обычно связана с инфицированием, которое происходит в начале посевного сезона, и приводит к большим экономическим потерям. TMV демонстрирует мировое распространение в умеренных и тропических регионах.Нет известных векторов, и передача происходит при механическом контакте. Вирус может оставаться в растительных остатках, почве и воде в течение длительного времени. Было описано несколько эффективных противовирусных агентов против TMV и других вирусов растений [11], несмотря на интенсивные исследования с использованием синтетических и природных соединений, направленных на достижение этой цели [12]. В период с 2012 по 2015 год было протестировано около 264 соединений с целью достижения защиты от TMV, в том числе семь из грибов [12].

Наше исследование было направлено на оценку эффекта видов GlcCer, выделенных и очищенных из F .Клеточная стенка oxysporum на индукцию устойчивости к инфекции TMV у растений Nicotiana tabacum cv Xanthi. Насколько нам известно, это первый отчет, в котором исследуется роль цереброзида в индукции устойчивости к вирусным заболеваниям растений.

Методы

Микроорганизмы и условия культивирования

Fusarium oxysporum (IOC 4247) был любезно предоставлен доктором Марией Инес Саркис из коллекции культур грибов FIOCRUZ и содержался в модифицированной среде Сабуро (SAB-M, 2% глюкозы, 1% пептона и 5% дрожжевого экстракта).Клеточную массу получали выращиванием гриба на среде Sab-M при встряхивании в течение семи дней при комнатной температуре.

Экстракция и очистка гликосфинголипидов из

Общие липиды из F . oxysporum Мицелий , выращенный в SAB-M, последовательно экстрагировали при комнатной температуре, используя хлороформ / метанол 2: 1 (об. / Об.) И 1: 2 (об. / Об.), Как описано Vieira et al. . [13]. Неочищенный липидный экстракт разделяли смесью хлороформ / метанол / 0.75% KCl (8: 4: 3 об. / Об.), Как описано Folch et al . [14]. Нижний слой Фолча, содержащий нейтральные липиды, фракционировали на колонке с силикагелем, которую последовательно элюировали хлороформом, ацетоном и метанолом. Фракции, содержащие гликосфинголипид, загружали на новую колонку с силикагелем и элюировали смесью хлороформ / метанол с возрастающей полярностью (90:10, 80:20, 70:30 и 50:50) [15]. Гликосфинголипиды, выделенные после очистки, контролировали с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах с силикагелем 60, проявленных смесью хлороформ / метанол / 2М гидроксид аммония, 40: 10: 1 (об. / Об.).Пятна визуализировали с помощью йода и орцинола / H ₂ SO ₄ [16, 17].

Анализ сахара

Для анализа моносахаридных компонентов частицы GlcCer гидролизовали 3 М трифторуксусной кислотой при 100 ° C в течение 3 часов, как описано Calixto et al . [18]. Моносахариды были обнаружены с помощью тонкослойной хроматографии в смеси н-бутанол / ацетон / вода (4: 5: 1 об / об / об) и визуализированы с использованием реагента орцинол-серная кислота [18]. Сахара были идентифицированы путем миграции с эталонными сахарами (рамноза, глюкоза, манноза и галактоза).

Анализ ESI-MS

GlcCer анализировали ионизацией электрораспылением (ESI-MS) в режиме положительных ионов (ESI +) с использованием прибора ESI-ion Trap (модель Amazon SL, Bruker, Германия). Виды GlcCer растворяли в смеси хлороформ / метанол / вода (5: 4: 1 об. / Об.), Содержащей 1 мМ хлорида лития, и анализировали путем прямой инъекции с использованием микрошприцевого насоса (Hamilton) [18]. Азот использовался в качестве небулайзера и газа-носителя.

Растениеводство

Семена Nicotiana tabacum cv.Ксанти проращивали в субстрате Top Garden Floreira Substrate® с добавлением вермикулита (1: 1) и хранили в теплице с контролем температуры (25 ° C +/- 2 ° C) в течение 30 дней. После прорастания проростки переносили в отдельные горшки, содержащие тот же субстрат и вермикулит, пока не вырастили растения с шестью настоящими листьями, которые использовали в экспериментах.

Вирусный посевной материал

Вирусный инокулят получали из листьев Nicotiana tabacum SR1, предварительно инфицированных TMV и хранимых при -80 ° C.Около 1 г замороженных листьев мацерировали 10 мл 0,01 М фосфатного буфера, pH 7,0. Мацерат разбавляли в 10 раз фосфатным буфером 0,01 М, pH 7,0, и полученную вирусную суспензию механически инокулировали в три полностью разросшихся листа на растение.

Оценка защитных и инактивирующих эффектов видов GlcCer

Устройство высокого давления (W550, Wagner) использовали для помощи в разрушении клеток путем вставки видов GlcCer в листья, как описано в [19], 30-дневные растения N . tabacum Xanthi по меньшей мере с шестью настоящими листьями опрыскивали в теплице фосфатным буфером (0,01 М, pH 7,0), содержащим 100 мкг / мл ^-1 видов GlcCer (десять растений) или только фосфатным буфером (десять растений). Через 24 часа по три листа с каждого растения в двух группах механически инокулировали TMV. В качестве положительного контроля вирусной инфекции дополнительную группу из пяти опрыскиваемых растений, не относящихся к GlcCer, механически инфицировали TMV.

Чтобы оценить, может ли положение или возраст листьев влиять на защитный эффект видов GlcCer против TMV, было проведено две серии экспериментов в общей сложности на 20 растениях каждая.В одном наборе листья в положениях 1, 2 и 3 десяти обработанных GlcCer растений и десяти обработанных буфером растений были инокулированы TMV, а во втором наборе экспериментов инокуляция TMV проводилась на листьях в положениях 4, 5 и 6 из другого набора из десяти обработанных GlcCer и десяти обработанных буфером растений. Эксперименты повторяли 3 раза с листьями 1, 2 и 3 и 2 раза с листьями 3, 4 и 5, и полученные значения были показаны как усредненные.

Оценивали эффект обработки видами GlcCer на растения, ранее инфицированные TMV.TMV механически наносили на поверхность N . tabacum листьев. Через 24 часа 12 независимых растений опрыскивали 100 мкг / мл раствора GlcCer: буфер, и такое же количество растений опрыскивали фосфатным буфером в качестве отрицательного контроля.

Чтобы проанализировать, могут ли виды GlcCer инактивировать вирусные частицы, экстракты, обогащенные TMV, полученные, как описано ниже, инкубировали с GlcCer (500 мкг / мл ^-1 ) в течение 1 часа при 25 ° C. После этого периода виды GlcCer, содержащие суспензию вируса, механически инокулировали в три листа десяти растений табака.

Количественное определение вируса

PathoScreen® (Agdia) ELISA для специфического обнаружения вирусов семейства тобамовирусов, включая TMV, был использован для идентификации присутствия TMV в инфицированных растениях в соответствии с протоколом Agdia. Для количественного определения вируса получали стандартную кривую путем серийного разбавления 2,0 × 10 ⁷ частиц TMV / г образца листа. Образцы листьев растений, обработанных GlcCer и обработанных буфером, инокулированных TMV, собирали через 72 часа после заражения вирусом. Образцы разбавляли 1:10 буфером для экстракции (Adgia Co.).

Просвечивающая электронная микроскопия

Чтобы исследовать влияние видов GlcCer на вирусные частицы, была проведена просвечивающая электронная микроскопия в соответствии с методологией, описанной Zhang et al . [10] с некоторыми изменениями, описанными ниже. Для приготовления образца вируса используют 2 г листьев N . tabacum SR1, инфицированный TMV, мацерировали 15 мл 0,01 мМ калий-фосфатного буфера, pH 7. Для удаления остатков листьев и других загрязнений образец центрифугировали на центрифуге Minispin Eppendorf дважды при 12000 об / мин в течение 5 мин, с F -45-12-11 ротор.Супернатант фильтровали через фильтр с размером пор 22 мкм. Для осаждения TMV проводили ультрацентрифугирование при 40000 об / мин в течение 1 часа 30 минут при 10 ° C с ротором SW40. Осадок, содержащий вирус, ресуспендировали в 1 мл 0,01 мМ калий-фосфатного буфера. Раствор TMV смешивали с равным объемом GlcCer (500 мкг / мл ^-1 ) и инкубировали в течение 1 ч при 25 ° C. После инкубации вирусные частицы, обработанные GlcCer, наблюдали с помощью просвечивающей электронной микроскопии с использованием отрицательного контраста с уранилацетат на микроскопе Tecnai G2 F20 FEG (FEI Company, Эйндховен, Нидерланды).TMV, инкубированный только с буфером, использовали в качестве контроля.

Оценка степени тяжести заболевания

TMV-инфекция в N . tabacum cv. Xanthi вызывает образование некротических поражений, характерных для гиперчувствительного ответа (HR) в инокулированных листьях. Вызванные TMV поражения HR на листьях растений были идентифицированы визуальным осмотром и подсчитаны через 72 часа после заражения TMV.

Статистический анализ

Статистический анализ всех экспериментов проводился с использованием критерия Стьюдента.Данные были построены с использованием GraphPad Prism v5.0 (http://www.graphpad.com) для создания графиков.

Определение общего фенольного содержания

Общее содержание фенолов в водных экстрактах оценивали с использованием реагента Folin-Ciocalteau [20] с модификациями. № . tabacum листьев были получены с использованием видов GlcCer и собраны в разное время. Водные экстракты получали путем мацерации листьев в дистиллированной воде с помощью фарфоровой ступки и пестика с последующей фильтрацией и лиофилизацией.Сто миллиграммов лиофилизированных экстрактов восстанавливали в 1 мл 70% водного ацетона. В 96-луночном микротитровальном планшете в каждую лунку добавляли 12,5 мкл экстрактов и 25 мкл реагента Фолина-Чокальтеу. Наконец, в лунки добавляли 187,5 мкл дистиллированной воды и 25 мкл Na ₂ CO ₃ (20% в воде) и реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 1 часа, после чего результаты считывали. при 660 нм в ридере ELISA.

Калибровочная кривая с использованием галловой кислоты в концентрациях от 10 до 500 мг.Был получен мл ^-1 , и общее содержание фенолов в экстрактах выражали в эквивалентах галловой кислоты (EAG) в мг на 1 г лиофилизированного экстракта.

Гистохимическая визуализация образования перекиси водорода и супероксидных радикалов

Для оценки образования перекиси водорода и супероксидных радикалов после обработки частицами GlcCer, листья N . tabacum cv Xanthi собирали после 30 мин, 1, 3 и 6 ч инкубации с GlcCer.Метод гистохимической визуализации, описанный Wang et al ., 2016, был использован с модификациями. Производство перекиси водорода было обнаружено с использованием раствора, содержащего диаминобензидин (DAB) в концентрации 1 мг / мл ^-1 , а супероксидные радикалы были обнаружены с использованием раствора, содержащего нитросиний тетразолиевый реагент (NBT) в концентрации 0,5 мг. .ml ^-1 . Листья погружали в чашки Петри, содержащие любой из этих растворов, и выдерживали в вакуумной камере (400 бар) в темноте в течение одного часа.Затем листья кипятили в абсолютном этаноле для удаления хлорофилла, чтобы обеспечить лучшую визуализацию осадков, образованных DAB или NBT.

Экстракция РНК

Оставить образцы из N . tabacum cv. Ксанти собирали в разное время после обработки 100 мкг / мл видов ^-1 GlcCer или 0,01 М фосфатным буфером и группировали в два пула по десять растений в каждом на обработку и время. Образцы немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C до использования.Для экстракции РНК листья измельчали ​​в жидком азоте до образования порошка, который переносили в пробирку Эппендорфа и выдерживали при -80 ° C для последующей экстракции полной РНК.

Суммарную РНК экстрагировали с использованием Trizol (Thermo Fisher Scientific Co.) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию и чистоту определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop2000 (Thermo Fisher Scientific Co.). Целостность РНК подтверждали электрофорезом в 0,8% агарозном геле в трис-ацетатном буфере (0.5x) с последующим окрашиванием бромистым этидием. Образцы РНК обрабатывали ДНКазой, свободной от РНКазы RQ1 (Promega Co.), перед реакциями обратной транскрипции.

Реакция с обратной транскриптазой и количественная ПЦР в реальном времени

Синтез комплементарной ДНК (кДНК) осуществляли с использованием 1 мкг общей РНК, обратной транскриптазы SuperScript IV (Thermo Fisher Scientific Co.) и 100 мкМ праймера Oligo dT. После синтеза кДНК образцы разбавляли в 25 раз водой MilliQ.

реакций RT-qPCR проводили в 96-луночных планшетах, содержащих на лунку 2.5 мкл кДНК, 6 мкл основной смеси SYBR Green / ROX qPCR (Thermo Fisher Scientific), 0,6 мкл прямого и обратного праймеров (10 мМ) каждого анализируемого гена и вода MilliQ до конечного объема 25 мкл. Реакции проводили в системе 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Анализы были сделаны на основе среднего технического трех повторностей для каждого биологического повторения, и относительная экспрессия была рассчитана методом 2 ^-ΔΔCt , следуя предложению Ливака и Шмитгена [21].Праймеры, используемые для анализа кПЦР, были описаны Mattos et al ., 2018. Температура отжига всех оцениваемых генов составляла 60 ° C, за исключением PAL и PR5 , температура отжига которых составляла 62 ° C. PR-1 (связанный с патогенезом белок-1 с предполагаемым противогрибковым действием), PR-2 (β-1,3-глюканаза), PR-3 (хитиназа), PR-5 (осмотин / тауматин -like), экспрессию генов PAL (фенилаланинаммиаклиаза), LOX (липоксигеназа) и POX (пероксидаза).PP2A (фосфатаза 2A) и Ntbuc (убиквитин) использовали для нормализации уровней экспрессии кДНК [22].

Влияние видов GlcCer на развитие растений

Оценить влияние обработки видами GlcCer на N . tabacum cv Xanthi, было отобрано 30 растений с равным количеством листьев и сопоставимого размера. Из них десять растений не обрабатывали, десять обрабатывали 0,01 М калий-фосфатным буфером и еще десять растений обрабатывали видами GlcCer в концентрации 100 мкг.мл ^-1 . Растения содержали в теплице и через 30 дней после этого измеряли их размеры без учета корней в сантиметрах.

Результаты

Экстракция и очистка видов GlcCer

экстрагировали хлороформом и метанолом в соотношении 2: 1, а затем 1: 2 (об. / Об.). Неочищенный экстракт фракционировали согласно Folch et al. [14]. Липиды нижней фазы фракционировали на колонке с силикагелем, элюируя хлороформом, ацетоном и метанолом.Виды GlcCer преимущественно присутствовали во фракции ацетона и были очищены последовательной хроматографией на силикагеле. Для дальнейшей очистки необходимо было элюировать колонку хлороформом и метанолом в различных концентрациях, как показано на рис. 1. Очищенный компонент элюировали смесью хлороформ / метанол 8: 2 и 7: 3 (об. / Об.). Подтверждение присутствия вещества на разных стадиях очистки контролировали с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ).

Химическая характеристика

Очищенные частицы GlcCer подвергали масс-спектрометрии с использованием ионизации электрораспылением (ESI-MS), обнаруживая три молекулярных иона с m / z [M + Li] 760, 776 и 790 (фиг. 2A). Эти ионы были подвергнуты второй фрагментации (MS2) с образованием более мелких фрагментов, таких как m / z 598,5, m / z 614,5 и m / z 628,5, которые соответствуют церамидной части молекулярных ионов m / z 760, 776 и 790 соответственно (рис. 2C, 2E и 2G).Гликосфинголипиды, представляющие m / z , 760, 776 и 790, были идентифицированы как N-2′-гидроксиоктадеценоик-1-β-D-глюкопиранозил-9-метил-4,8-сфингадиенин (Фиг.2D), N-2′- гидроксиоктадеканоик-1-β-D-глюкопиранозил-9-метил-4-гидрокси-4,8-сфингадиенин (рис. 2F) и N-2′-гидроксиэйкозаноил-1-β-D-глюкопиранозил-9-метил-4,8 -сфингадиенин (фиг. 2G) соответственно. Глюкоза была идентифицирована как моносахаридный компонент F . oxysporum GlcCer после гидролиза и анализа ТСХ (рис. 2В).

Рис. 2. ESI-MS (режим положительных ионов, Li + аддукты) анализ частиц GlcCer F . Оксиспорум .

(А) Спектр MS1. (C, E и G) ESI-MS2 видов ионов m / z 760, 776 и 790, наблюдаемых в (A) и предполагаемых структур для основных частиц GlcCer в F . oxysporum (D, F и H). (B) Планшет для ВЭТСХ моносахаридов из F . oxysporum CMH. 1. Стандарты галактозы, глюкозы и маннозы; 2.Глюкоза из КМЗ. Сахара определяли с помощью реагента для распыления орцинол-серная кислота.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0242887.g002

Виды GlcCer индуцируют защитный эффект против инфекции TMV у растений табака

Поскольку ранее сообщалось, что виды грибов цереброзида GlcCer вызывают защиту растений от поражения грибами, были проведены эксперименты, чтобы проверить, может ли это выявление также защитить растения от вирусных инфекций. Ф . oxysporum GlcCer видов в концентрации 100 мкг / мл ^-1 опрыскивали 30-дневные растения Nicotiana tabacum Xanthi в тепличных условиях с последующей механической инокуляцией TMV через 24 часа после выявления видов GlcCer. Число некротических поражений, вызванных TMV, подсчитывали через 72 часа после инокулята вируса (hpi). Резкое уменьшение количества индуцированных TMV некротических поражений наблюдалось в листьях растений, обработанных GlcCer (фиг. 3B).Наблюдаемое снижение составило 71% на листе 1, 56% на листе 2, 42,7% на листе 3, 75% на листе 4, 41,8% на листе 5 и 46% на листе 6, соответственно, по сравнению с контролем, который опрыскивали. с фосфатным буфером (рис. 3A и 3B). Листья с разных позиций инфицировали TMV, чтобы увидеть, может ли положение листа повлиять на эффект толерантности к TMV. Более молодые листья, по-видимому, проявляют более выраженный ответ против вируса с большим сокращением количества некротических повреждений, чем более развитые листья из положений 5 и 6.Листья из положения 4 неожиданно показали более высокую степень защиты (75%), чем листья из положений 2 и 3. Помимо снижения количества некротических повреждений, титр вируса также показал снижение в листьях, обработанных видами GlcCer (рис. 3C), с помощью количественного определения вируса. ELISA. Фиг. 3B показывает характерную картину некротических поражений HR, наблюдаемых на каждом листе после обработки буфером и GlcCer. Рис. 3D Схема положения оцениваемых листьев. Эти результаты ясно демонстрируют способность видов GlcCer частично защищать растения N . tabacum cv Xanthi в 55,75% против TMV-инфекции.

Рис. 3.

(A) Количество некротических поражений, наблюдаемых у Nicotiana tabacum cv. Растения Xanthi индуцировали видами GlcCer или буфером (CTL) и механически инокулировали TMV через 24 часа после обработки. Некротические поражения подсчитывали через 72 часа после инокуляции вируса. (B) Репрезентативное изображение некротических поражений в N . Tabacum cv Xanthi всех листьев оценивали через 72 часа инокулята TMV. В качестве контроля (CTL Buffer) листья обрабатывали только фосфатным буфером (верхняя строка), тогда как в нижней строке листья обрабатывали 100 мкг.мл ^-1 GlcCer. (C) Титр TMV в инфицированных растениях, обработанных видами GlcCer или буфером за 72 часа до инокуляции TMV. (D) Схема положения оцениваемых листьев. Звездочки обозначают значения, статистически отличающиеся от контрольных ** P <0,01, *** P <0,001. *** П <0,0001.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0242887.g003

Оценка действия видов GlcCer на растения, ранее инфицированные TMV

Наши предыдущие эксперименты показали, что виды GlcCer могут защищать растения табака от последующих вирусных инфекций.Однако лечение видами GlcCer не так эффективно помогает инфицированным растениям уничтожить вирус, когда инфекция уже установлена. Растения табака механически инокулировали TMV и через 24 часа опрыскивали 100 мкг / мл ^-1 видов GlcCer. Было замечено, что постинфекционная обработка видами GlcCer уменьшала количество некротических повреждений TMV на листьях в положениях 1, 2 и 3 на 36%, 32,5% и 27,8%, соответственно, по сравнению с контролем (рис. 4A). показывая, что обработка видами GlcCer может уменьшить количество поражений, когда растение уже было инфицировано.

Рис. 4. Оценка обработки видов GlcCer в ранее инфицированных растениях и инкубации видов GlcCer с TMV в N . tabacum cv. Ксанти растения.

(A) Влияние частиц GlcCer, распыленных на N . tabacum cv Xanthi через 24 часа после заражения TMV на листьях 1, 2 и 3. (B) Инфекционность TMV частиц TMV, предварительно инкубированных с видами GlcCer в течение 1 часа и инокулированных в N . tabacum cv Xanthi в листьях 1, 2 и 3.(C) Просвечивающая электронная микроскопия необработанных частиц TMV (CTL) и TMV частиц, обработанных видами GlcCer из F . Оксиспорум . Полосы = 1 мкм. Значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение десяти независимых экспериментов. нс = нет существенной разницы. Звездочки обозначают значения, статистически отличающиеся от контрольных. * P = 0,0386.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0242887.g004

Эффект предварительного лечения TMV видами GlcCer

Чтобы понять, помогает ли вид GlcCer растению уничтожить вирус либо путем укрепления его иммунной системы, либо путем инактивации вируса в инфицированном растении, TMV инкубировали in vitro с F . oxysporum GlcCer в течение одного часа, а затем механически инокулировали в N . tabacum растений Xanthi. Не наблюдалось существенной разницы в количестве некротических поражений на растениях, которые получали частицы вируса ВТМ, предварительно инкубированные с видами GlcCer, по сравнению с контролем (фиг. 4В).

После инкубации вирус наблюдали с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Микроскопия показала, что частицы TMV, обработанные видами GlcCer, по-видимому, не претерпели видимых морфологических изменений.Форма большинства частиц TMV осталась неизменной, но мы наблюдали явление агрегации частиц (рис. 4C). Агрегация частиц TMV, наблюдаемая после инкубации вируса с видами GlcCer in vitro, по-видимому, не влияла на инфекционность вируса, поскольку не наблюдали различий между количеством некротических повреждений между обработками.

Оценка общего содержания полифенолов после обработки GlcCer

Путь фенольного метаболизма отвечает за производство нескольких вторичных метаболических соединений, которые усиливают защиту растений при биотическом и абиотическом стрессе.Чтобы увидеть, активируется ли фенольный путь видами GlcCer, мы определили содержание фенольных соединений N . tabacum cv Xanthi после обработки вида GlcCer. Общее количество полифенолов в экстрактах листьев оценивали с использованием метода Folin-Ciocalteu и выражали в миллиграммах эквивалентов галловой кислоты на грамм. Анализируя общие уровни полифенолов в разное время после обработки 100 мкг / мл ^-1 видов GlcCer (рис. 5A), мы наблюдали значительное увеличение синтеза полифенолов через 48 часов (23%) и 7 дней (19%) по сравнению с контролем. растения обрабатывают буфером.

Рис. 5.

(A) Общее содержание полифенолов в водных экстрактах N . Tabacum cv Xanthi, обработанный видами GlcCer (100 мкг / мл ^-1 ) и собранный через 24, 48 часов и 7 дней после выявления (24 часа, 48 часов и 7 дней). (B) Гистохимическая визуализация накопления активных форм кислорода (АФК) в листьях Nicotiana tabacum cv. Xanthi собирали в разное время после обработки GlcCer видов F . Оксиспорум .Слева накопление H ₂ O _2, подтверждается коричневой окраской (осаждение DAB). Справа о накоплении O₂⁻ свидетельствует синий цвет (осаждение NBT). Значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех разных растений. нс = нет существенной разницы. Звездочки обозначают статистически разные значения. * P = 0,036 и ** P = 0,022.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0242887.g005

Обработка GlcCer вызывает накопление активных форм кислорода (ROS)

Одна из первых линий защиты растений — это накопление активных форм кислорода (АФК).Гистохимический анализ накопления ROS был проведен в растениях, обработанных видами GlcCer, через 0,5–6,0 ч после обработки с использованием диаминобензидина (DAB) для оценки присутствия H ₂ O ₂ или нитросинего тетразолия (NBT) для оценки присутствия из O ₂ ^— (Рис. 5B). Накопление H₂O₂ наблюдали во все тестируемые моменты времени. Более того, интересно отметить, что самые высокие уровни накопления H ₂ O ₂ были достигнуты через 6 часов.Также можно было наблюдать, что накопление O₂⁻ происходит во все тестируемые моменты времени, с максимальными значениями, достигнутыми через 3 и 6 часов. Эти результаты показывают, что виды GlcCer способны индуцировать продукцию ROS в растениях табака и активировать классическую первую линию защиты.

Анализ экспрессии генов защиты растений

Оценить влияние обработки видами GlcCer на индукцию SAR в N . tabacum cv Xanthi, экспрессию нескольких генов, связанных с защитой, оценивали с помощью ПЦР в реальном времени между 1 и 120 часами после обработки (фиг. 6).Все четыре проанализированных гена PR показали сильную индукцию видами GlcCer. Экспрессия гена PR1, классического маркера SAR, начала увеличиваться через шесть часов после обработки видами GlcCer и сохраняла свою экспрессию на высоком уровне почти во все моменты времени, достигая пика экспрессии через 120 часов, когда он был экспрессирован в 147,7 раз больше, чем в контрольных растениях. Ген PR2, который кодирует β- (1,3) глюканазу и также считается маркером SAR, достиг максимальной экспрессии через шесть часов, будучи в 104,5 раза более выраженным, чем в контроле.Через 24 часа его экспрессия все еще была в 54,6 раза выше, чем в контроле. Ген PR3, кодирующий хитиназу, также имел самый высокий уровень экспрессии через шесть часов (454,8 раза) и оставался очень высоким через 24 часа (409,6 раза). Тауматин-подобный ген PR5 показал более позднюю индукцию с наивысшим пиком экспрессии через 24 часа, будучи в 448,2 раза более выраженным, чем в контроле. Однако его выраженность со временем уменьшалась.

Рис. 6. Экспрессия генов, связанных с защитой растений N . tabacum cv Xanthi, обработанные GlcCer видами F . oxysporum в разное время.

PR1 : предполагаемая противогрибковая функция, PR2 : β — (1,3) глюканаза; PR3 : хитиназа; PR5 : подобный осмотину; POX : пероксидаза; LOX : липоксигеназа и PAL : фенилаланин-аммиаклиаза. Конститутивные гены, используемые для нормализации: PP2A, и убиквитин. Анализы проводили на основе среднего значения двух биологически независимых экспериментов и трех технических повторений каждого биологического повторения, и относительную экспрессию рассчитывали методом 2 ^-ΔΔCt .Звездочки обозначают значения, статистически отличающиеся от контрольных. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0242887.g006

В поисках других классических маркеров активации защиты растений мы обнаружили, что пик липоксигеназы (LOX) экспрессируется через 12 часов, будучи в 143,7 раза более выраженным. чем в контрольных растениях, и оставался на очень высоком уровне экспрессии в более поздние моменты времени.Ген пероксидазы (POX) показал первое повышение экспрессии через три часа, в 3,6 раза больше экспрессии, достигнув пика экспрессии через шесть часов с увеличением в 137,6 раза. Эти данные согласуются с данными, наблюдаемыми в эксперименте по гистохимии ROS, где более высокое накопление H ₂ O ₂ наблюдалось через шесть часов после обработки GlcCer.

Оценка гена филлаланин-аммониализы (PAL), который кодирует первый фермент фенольного пути, показала, что его экспрессия сильно индуцировалась обработкой видами GlcCer.Транскрипты PAL впервые увеличили экспрессию через шесть часов, достигнув пика экспрессии через 24 часа после обработки, будучи в 219 раз более выраженной, чем в контроле.

Эти результаты показывают, что обработка F . oxysporum GlcCer был способен вызывать сильное увеличение экспрессии генов с течением времени, особенно через шесть часов, что указывает на то, что все проанализированные гены активируются рано после лечения и индуцируются SAR.

Виды GlcCer не влияют на развитие растений табака

GlcCer, по-видимому, положительно влияют на рост растений.Во время экспериментов в теплице было замечено, что растения, обработанные видами GlcCer, были более здоровыми и более сильными, чем контрольные растения, обработанные буфером. Поэтому был проведен эксперимент, чтобы оценить, могут ли виды GlcCer влиять на высоту растений. Оценка высоты растений, обработанных видами GlcCer, и необработанных растений показала, что растения, обработанные видами GlcCer, были на 23,5% выше, чем растения, обработанные буфером, и на 30,3% выше, чем необработанные контрольные растения и, следовательно (фиг. 7). Таким образом, в отличие от некоторых других противовирусных соединений, виды GlcCer не задерживают рост растений и, кажется, даже улучшают его.

Рис. 7. Влияние видов GlcCer на высоту растений.

Виды GlcCer 100 мкг / мл ^-1 раствор использовали для опрыскивания растений и контроля. CTL — необработанные растения, буферные растения, опрысканные калий-фосфатным буфером 0,01 М, и виды GlcCer: растения, опрысканные глюкозилцерамидом в концентрации 100 мкг / мл ^-1 . Измерение размеров 10 растений для каждой обработки производили через 30 дней после опрыскивания. ** P = 0,0014 и *** P = 0,0004.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0242887.g007

Обсуждение

Чтобы решить проблему неизбирательного использования сельскохозяйственных пестицидов, исследователи со всего мира ищут новые варианты борьбы с патогенами, которые являются эффективными, экономичными и оказывают незначительное воздействие на окружающую среду. Многообещающей альтернативой является использование индукторов защиты растений, отдельно или в сочетании с полезными микроорганизмами или пестицидами [23]. Биоэстимуляторы, элиситоры или активаторы защиты растений обычно вызывают широкий спектр системной устойчивости [24] со значительным уменьшением симптомов заболевания, вызванного различными типами патогенов [25].Стратегия, которой следовали, является использование механизмов, предназначенных для активации индуцированной или конститутивной защитной реакции с целью предотвращения колонизации растений фитопатогенами [26]. Молекулы элиситора способны вызывать у растений защитную реакцию, повышать иммунитет и снижать их восприимчивость к заболеваниям, вызываемым фитопатогенами [27]. Эти молекулы могут быть извлечены непосредственно из микроорганизмов или синтезированы в лаборатории [28]. В 2003 году Нарасимхан и его сотрудники продемонстрировали увеличение экспрессии гликопротеинов клеточной стенки F . oxysporum f. sp. nicotianae соответствовали более серьезным поражениям, представленным в листьях табака [29]. Несколькими годами ранее Koga et al . [30] выделили и идентифицировали соединения с элиситорным действием из грибка Magnaporthe grisea , и фитопатоген риса. Структуры этих соединений были проанализированы и были идентифицированы как сфинголипиды. Обработка листьев риса этими цереброзидами способствовала индуцированию выработки и накопления фитоалексинов, гибели клеток и повышению устойчивости к совместимым патогенам.

В данной работе мы предлагаем использовать виды глюкозилцерамидов (GlcCer), экстрагированные из мицелия F . oxysporum как активатор иммунитета растений в качестве альтернативного метода борьбы с болезнями, поражающими растения. Три молекулярных вида GlcCer были идентифицированы масс-спектрометрией в F . oxysporum с m / z 760, 776 и 790, содержащий длинноцепочечное основание, 9-метил-4,8-сфингадиенин, связанный амидной связью с 2-гидроксиоктадеценовой кислотой (C18: 1 OH), 2-гидроксиоктадекановой кислота (C18: OH) и 2-гидроксиэйкозановая кислота (C20: OH) соответственно.Эти структуры аналогичны структурам других грибов [31, 32], например, A . fumigatus , С . albicans и Scedosporium , что свидетельствует о консервативных характеристиках этой молекулы у различных изученных грибов. Основание с длинной цепью (9-метил-4,8-сфингадиенин) и гидроксилированные жирные кислоты присутствуют во всех этих грибах, и разница между этими молекулами возникает в отношении ненасыщенности и размера цепи жирной кислоты [31].Несколько исследований продемонстрировали важность этой молекулы в важнейших процессах для грибковых клеток, таких как дифференциация, рост и жизнеспособность клеток [31], что может объяснить, почему эти гликосфинголипиды высоко консервативны среди различных видов.

Исследования показывают, что другие вещества уже использовались в качестве индукторов устойчивости к ВТМ, как в случае Мунронина О, выделенного из растения Munronia henryi Harms, которое проявляет лечебную, защитную и инактивирующую активность ВТМ выше, чем у нингнанмицина. [33].Zhao и соавторы также показали, что применение жирных кислот (олеиновой кислоты) может повысить устойчивость к TMV, а противовирусная активность может быть связана с активированной экспрессией ряда генов, связанных с защитой, как это было сделано в нашей работе [34].

Умемура и др. . [6] очищенный цереброзид С из различных штаммов Fusarium oxysporum . Эта молекула соответствует описанному в нашей работе N-2′-гидроксиоктадеценоил-1-β-D-глюкопиранозил-9-метил-4,8-сфингадиенину.Однако здесь мы характеризуем еще два цереброзида, N-2′-гидроксиоктадекановый -1-β-D-глюкопиранозил-9-метил-4-гидрокси-4,8-сфингадиенин и N-2′-гидроксиэйкозаноил-1-β. -D-глюкопиранозил-9-метил-4,8-сфингадиенин. Жирная кислота 2-гидроксиэйкозановая кислота (C20: OH) впервые описана в Fusarium oxysporum GlcCer, выделенном в настоящей работе.

Анализ воздействия F . oxysporum цереброзид GlcCer обработки растений табака, мы оценили влияние на продукцию фенольных соединений.Наши результаты показали, что виды GlcCer могут индуцировать производство фенольных соединений в растениях табака в зависимости от времени. Полифенолы — это вторичные метаболиты, синтезируемые по пути фенилпропаноидов. Полифенолы в изобилии содержатся в самых разных продуктах питания, таких как фрукты, овощи, семена и злаки, а также в напитках, таких как вино. В настоящее время они являются темой большого научного внимания из-за интереса к их потенциальной пользе для здоровья. Кроме того, класс флавоноидов и изофлавоноидов также может действовать как фитоалексины из-за их противогрибкового и антибактериального действия [35].

Согласно Heller и Tudzynski [36], активные формы кислорода играют фундаментальную роль во взаимодействиях между патогенами и растениями, и это одно из первых событий, которые происходят при распознавании патогена растением. Помимо своего прямого антимикробного эффекта, генерация АФК также участвует в передаче клеточных сигналов, связанных с экспрессией генов, связанных с патогенезом (PR), реакцией гиперчувствительности (HR), а также с развитием SAR [36, 37]. В 2010 году Ким и его сотрудники сообщили, что A . thaliana растений, которые сверхэкспрессировали ген RCI3, кодирующий пероксидазу, имели увеличение продукции АФК в корнях, когда эти растения имели низкую доступность калия [38]. Кроме того, Choi и соавторы также продемонстрировали, что сверхэкспрессия A . thaliana Ген CapO2, который кодирует внеклеточную пероксидазу в перце, увеличивал концентрации H ₂ O ₂ в ответ на заражение бактерией Pseudomonas syringae [39].Чтобы исследовать способность видов GlcCer индуцировать синтез АФК, мы оценили генерацию супероксидного радикала и экспрессию гена пероксида водорода и пероксидазы в растениях табака. Обработка F . Виды oxysporum GlcCer были способны индуцировать продукцию O ₂ ^— и H ₂ O ₂ , как обнаружено с помощью гистохимических анализов. Наибольшее накопление произошло через 6 часов и совпадает с пиком экспрессии POX, как показывает RT-qPCR.

Умемура и др. . [6] продемонстрировали, что обработка растений салата, томата, дыни и сладкого картофеля цереброзидом грибов способна индуцировать продукцию ROS и экспрессию генов PR , защищающих эти растения от F . oxysporum инфекция. Кроме того, Ван и др. . [40] продемонстрировали, что белок PeBA1, экстрагированный из Bacillus amyloliquefaciens , способен защищать N . tabacum против инфекции TMV, демонстрируя активность молекулы бактериального происхождения против вирусного заболевания.Наблюдаемые здесь результаты впервые показывают, что грибок GlcCer может действовать как возможное противовирусное средство в растениях. Видовая обработка GlcCer N . Растения tabacum cv Xanthi индуцировали снижение количества некротических повреждений минимум на 42,8% по сравнению с контролем. Было обнаружено снижение на 75% в более молодых листьях, что указывает на противовирусный потенциал видов GlcCer.

Выявление защиты у растений обычно связано с индукцией SAR.Среди генов, обычно индуцируемых во время установления SAR, повышенная экспрессия PR1 признана одним из основных маркеров SAR [29, 41]. Подавление PR1 в Arabidopsis thaliana привело к большей восприимчивости к инфекции оомицетов Phytophthora parasitic , тогда как N . Растения tabacum , показавшие сверхэкспрессию гена PR1, показали повышенную устойчивость против Phytophthora parasitic и Peronospora tabacina [42, 43].Здесь можно было наблюдать, что экспрессия гена PR1 сильно индуцирована в течение различных периодов тестирования, что указывает на активацию SAR. Два гена, кодирующие ферменты с противогрибковым действием, такие как PR3 (хитиназа) и PR2 ( β — (1,3) глюканаза), имели сходный профиль экспрессии с повышенной экспрессией между 6 и 24 часами.

Как упоминалось ранее, установление SAR опосредуется накоплением салициловой кислоты (SA) в тканях, удаленных от места инфекции, и это накопление отвечает за запуск пути защитной реакции.В табаке основной путь синтеза салициловой кислоты проходит через фенилпропаноидный путь, который опосредуется действием фермента PAL [44]. Повышенная экспрессия этого гена связана с быстрым накоплением СК [28]. Наши результаты показали, что активность PAL быстро увеличивалась в обработанных растениях. PAL — это фермент, который катализирует первый этап метаболизма фенилпропаноидов. Активность PAL достигла своего первого пика в первые шесть часов, после чего последовало постепенное увеличение через 24 и 96 часов после выявления.

Все гены, связанные с защитой растений, изученные в этой работе, показали сильное увеличение их экспрессии в период до 6 часов после обработки видами GlcCer, за исключением гена, кодирующего пероксидазу ( POX ), который ранее значительно увеличивался, через 3 ч. Эти данные предполагают не только установление SAR, но также указывают на быстрое развитие этого ответа.

Высокая экспрессия почти всех протестированных генов была обнаружена после периода базовой экспрессии или даже репрессии.Мы предполагаем, что эти результаты могут быть связаны с циркадным циклом. Белок NPR1 играет важную роль в транскрипции генов, связанных с циркадным циклом, а также участвует в развитии защитных реакций растений и установлении SAR [45, 46]. Эта динамика между экспрессией защитных генов и взаимосвязью с циркадным циклом может быть связана с результатами, описанными выше.

Наши результаты согласуются с результатами, описанными Naveen et al .[7], где защитные механизмы растений перца ( Capsicum annum ) индуцируются после обработки цереброзидом, экстрагированным из фитопатогена перца Colletotrichum capsici . Эта молекула была способна индуцировать первоначальное накопление H ₂ O ₂ и увеличивать продукцию ферментов PAL, POX и LOX. Кроме того, он смог защитить растение от заражения C . капсичи . Исследования Умемуры и др. .[47] также продемонстрировали, что цереброзиды, экстрагированные из Magnaporthe grisea , участвуют в производстве фитоалексинов и белков PR в листьях риса. В полевых экспериментах цереброзидные элиситоры эффективно защищали рисовые растения от грибкового грибка, который является экономически разрушительным возбудителем болезни риса в Японии. Цереброзиды также защищали рисовые растения от других болезней. Эти соединения присутствуют в большом количестве различных фитопатогенов и действуют как общие элиситоры во множестве взаимодействий между рисом и патогенами [47].

По результатам, описанным в данной работе, можно предположить, что F . oxysporum глюкозилцерамид является сильным индуктором системной приобретенной устойчивости, которая, следовательно, вызывает высокий антивирусный статус у обработанных растений. Защитный эффект, наблюдаемый после обработки, весьма выражен и указывает на то, что эта обработка может индуцировать толерантность к другому инфекционному вирусу растений. Чтобы проверить эту гипотезу, необходимо провести новые эксперименты.

Благодарности

Мы благодарим Centro de Espectrometria de Massas de Biomoléculas (CEMBIO) Федерального университета в Рио-де-Жанейро за анализ ESI-MS.Мы благодарим Татьяну Домитрович за помощь в получении вирусных частиц и Джефферсона Киприано за помощь с электронной микроскопией, а также Мариану Ингрид Дутра да Силва Ксисто и Родриго Роллен-Пиньейру за их поддержку и помощь в отправке статьи. Мы также благодарим Вальтера Мартина Роланда Олеманна за исправление английской грамматики рукописи.

Список литературы

1. 1. Пьетро А.Д., депутат парламента Мадрида, Каракуэль З., Дельгадо-Харана Дж., Ронсеро Мичиган. Fusarium oxysporum: изучение молекулярного арсенала гриба сосудистого увядания.Мол Растение Патол. 2003. 4 (5): 315–25. pmid: 20569392.
2. 2. Ма Л.Дж., Гейзер Д.М., Проктор Р.Х., Руни А.П., О’Доннелл К., Трейл Ф и др. Патогеномика фузариоза. Annu Rev Microbiol. 2013. 67: 399–416. pmid: 24024636.
3. 3. Эдель-Херманн В., Леконт С. Текущее состояние Fusarium oxysporum Formae Speciales и рас. Фитопатология. 2019; 109 (4): 512–30. pmid: 30461350.
4. 4. Уильямс А.Х., Шарма М., Тэтчер Л.Ф., Азам С., Хейн Дж. К., Спершнайдер Дж. И др.Сравнительная геномика и прогнозирование условно необязательных последовательностей в бобовых грибах Fusarium oxysporum formae speciales облегчает идентификацию возможных эффекторов. BMC Genomics. 2016; 17: 191. pmid: 26945779; PubMed Central PMCID: PMC4779268.
5. 5. Ли Х.Х., Сяо Й., Цао Л.Л., Янь Х, Ли С., Ши Х.Й. и др. Цереброзид С повышает устойчивость к переохлаждению и изменяет липидный состав корней пшеницы. PLoS One. 2013; 8 (9): e73380. pmid: 24058471; PubMed Central PMCID: PMC3772805.
6. 6. Умемура К., Танино С., Нагацука Т., Кога Дж., Ивата М., Нагашима К. и др. Цереброзид-элиситор придает устойчивость к фузариозу у различных видов растений. Фитопатология. 2004. 94 (8): 813–8. pmid: 18943100.
7. 7. Навин Дж., Харипрасад П., Наяка С.К., Ниранджана С.Р. Вызвание опосредованного цереброзидом защитного ответа у перца чили (Capsicum annuum L.) против инфекции Colletotrichum capsici. Журнал взаимодействий с растениями. 2013; 8 (1): 65–73.
8. 8.Селс Дж., Матис Дж., Де Конинк Б.М., Каммью Б.П., Де Болле М.Ф. Белки, связанные с патогенезом растений (PR): в центре внимания пептиды PR. Plant Physiol Biochem. 2008. 46 (11): 941–50. pmid: 18674922.
9. 9. Реймер-Михальски Е.М., Конрат У. Врожденная иммунная память у растений. Semin Immunol. 2016; 28 (4): 319–27. pmid: 27264335.
10. 10. Zhang G, Feng J, Han L, Zhang X. Противовирусная активность гликопротеина GP-1, выделенного из Streptomyces kanasensis ZX01. Int J Biol Macromol.2016; 88: 572–7. pmid: 270
    .
11. 11. Морейра С.Р., Эйрас М., Чавес А.Л.Р., Галлети С.Р., Колариччио А. Характеризация нового образца вируса мозаики томатов, изолированного от помидоров на Эстадо-де-Сан-Паулу. Fitopatologia Brasileira. 2003. 28: 602–7.
12. 12. Андреа Л., Алессио А., Эрика С., Марция В., Франческа Н., Элиана Н. и др. & lt; em & gt; Xylella fastidiosa & lt; / em & gt; subsp. & lt; em & gt; pauca & lt; / em & gt; (Штамм CoDiRO) инфицирование четырех оливок (& lt; em & gt; Olea europaea & lt; / em & gt; L.) сорта: профиль фенольных соединений в листьях и прогрессирование симптомов ожога листьев. Phytopathologia Mediterranea. 2017; 56 (2).
13. 13. Vieira ER, Xisto M, Pele MA, Alviano DS, Alviano CS, Barreto-Bergter E, et al. Моногексозилцерамиды из видов Rhizopus, выделенных из бразильского Caatinga: химическая характеристика и оценка их антибиотикопленочной и антибактериальной активности. Молекулы. 2018; 23 (6). pmid: 29865153; PubMed Central PMCID: PMC6100016.
14. 14.Folch J, Lees M, Sloane Stanley GH. Простой метод выделения и очистки общих липидов из тканей животных. J Biol Chem. 1957. 226 (1): 497–509. pmid: 13428781.
15. 15. Роллин-Пинейро Р., Липораги-Лопес Л.С., де Мейреллес СП, Соуза Л.М., Баррето-Бергтер Э. Характеристика глюкозилцерамидов Scedosporium apiospermum и их участие в развитии грибов и функциях макрофагов. PLoS One. 2014; 9 (5): e98149. pmid: 24878570; PubMed Central PMCID: PMC4039464.
16. 16. Боаш М.Х., да Силва М.С., де Оливейра Т.Г., Травассос Л.Р., Бергтер Е.Б. Реактивность чагасовых сывороток с неочищенными и высокоочищенными фракциями гликосфинголипидов из эпимастигот Trypanosoma cruzi. Анал J Clin Lab. 1994. 8 (5): 260–6. pmid: 7807279.
17. 17. da Silva AFC, Rodrigues ML, Farias SE, Almeida IC, Pinto MR, Barreto-Bergter E. Глюкозилцерамиды Colletotrichum gloeosporioides участвуют в дифференцировке конидий в мицелиальные клетки. FEBS Lett.2004. 561 (1–3): 137–43. WOS: 000220244100023. pmid: 15013765
18. 18. Каликсто Р.О., Роллен-Пинейро Р., да Силва М.И., Липораги-Лопес Л.С., Виейра Дж.М., Сассаки Г.Л. и др. Структурный анализ глюкозилцерамидов (GlcCer) видов комплекса Pseudallescheria / Scedosporium. Fungal Biol. 2016; 120 (2): 166–72. pmid: 26781373.
19. 19. Фу Й, Инь Х, Ван В., Ван М, Чжан Х, Чжао Х и др. β-1,3-Глюкан с разной степенью полимеризации вызывал разные защитные реакции у табака.Carbohydr Polym. 2011. 86 (2): 774–82. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2011.05.022.
20. 20. Холланд К.В., Балота М., Эйгель В.Н., 3-й, Малликарджунан П., Танко Дж. М., Чжоу К. и др. ORACхроматография и общее содержание фенолов в экстрактах корня арахиса. J Food Sci. 2011; 76 (3): C380–4. pmid: 21535803.
21. 21. Ливак К.Дж., Шмитген Т.Д. Анализ данных относительной экспрессии генов с использованием количественной ПЦР в реальном времени и метода 2 (-Delta Delta C (T)). Методы. 2001. 25 (4): 402–8.pmid: 11846609.
22. 22. Маттос Б.Б., Монтебьянко С., Романель Э., да Франка Силва Т., Бернабе Р.Б., Симас-Тосин Ф. и др. Пептидогалактоманнан, выделенный из Cladosporium herbarum, индуцирует связанные с защитой гены в клетках табака BY-2. Plant Physiol Biochem. 2018; 126: 206–16. pmid: 29525444.
23. 23. Уолтерс Д.Р., Ратсеп Дж., Хэвис Н.Д. Борьба с болезнями сельскохозяйственных культур с помощью индуцированной резистентности: задачи на будущее. J Exp Bot. 2013. 64 (5): 1263–80. pmid: 23386685.
24. 24.Уолтерс Д.Р., Фонтейн Дж. М.. Практическое применение индуцированной устойчивости к болезням растений: оценка эффективности в полевых условиях. Журнал сельскохозяйственных наук. 2009. 147 (5): 523–35. Epub 23.06.
25. 25. Куч Й. Что старого и нового в концепциях индуцированной системной резистентности растений и ее применении. В: Тузун С., Бент Э, ред. Мультигенная и индуцированная системная резистентность растений. Бостон, Массачусетс: Springer США; 2006. с. 9–20.
26. 26.Vogel-Adghough D, Stahl E, Navarova H, Zeier J. Пипеколиновая кислота повышает устойчивость к бактериальной инфекции и способствует накоплению салициловой кислоты и никотина в табаке. Сигнальное поведение растений. 2013; 8 (11): e26366. pmid: 24025239; PubMed Central PMCID: PMC4091605.
27. 27. Купер WR, Хортон DR. Элиситоры защиты растений-хозяев частично подавляют популяции Cacopsylla pyricola (Hemiptera: Psyllidae) в полевых условиях. J Insect Sci. 2017; 17 (2). pmid: 28365771; PubMed Central PMCID: PMC5416828.
28. 28. Трипати Д., Райхи Г., Кумар Д. Химические элиситоры системной приобретенной устойчивости — салициловая кислота и ее функциональные аналоги. Современная биология растений. 2019; 17: 48–59. https://doi.org/10.1016/j.cpb.2019.03.002.
29. 29. Нарасимхан М.Л., Ли Х., Дамс Б., Сингх Н.К., Ибеас Д.И., Мацумото Т.К. и др. Сверхэкспрессия гликопротеина клеточной стенки в Fusarium oxysporum увеличивает вирулентность и устойчивость к растительному белку PR-5. Плант Дж. 2003; 36 (3): 390–400. pmid: 14617095.
30. 30. Кога Дж., Ямаути Т., Шимура М., Огава Н., Осима К., Умемура К. и др. Цереброзиды А и С, сфинголипидные элиситоры гибели гиперчувствительных клеток и накопления фитоалексина в растениях риса. J Biol Chem. 1998. 273 (48): 31985–91. pmid: 9822670.
31. 31. Баррето-Бергтер Э., Пинто М.Р., Родригес М.Л. Структура и биологические функции цереброзидов грибов. An Acad Bras Cienc. 2004. 76 (1): 67–84. WOS: 000188545000007. pmid: 15048196
32. 32. Баррето-Бергтер Э., Сассаки Г.Л., де Соуза Л.М.Структурный анализ цереброзидов грибов. Front Microbiol. 2011; 2: 239. pmid: 22164155; PubMed Central PMCID: PMC3230030.
33. 33. Ян Й, Тан Л., Ху Дж, Ван Дж, Аделакун Т.А., Ян Д. и др. Мунронин О, потенциальный активатор устойчивости растений. Биохимия и физиология пестицидов. 2018; 146: 13–8. pmid: 29626987
34. 34. Zhao L, Chen Y, Wu K, Yan H, Hao X, Wu Y. Применение жирных кислот в качестве противовирусных агентов против вируса табачной мозаики. Биохимия и физиология пестицидов.2017; 139: 87–91. pmid: 28595927
35. 35. Оздал Т., Села Д.А., Сяо Дж., Бояджиоглу Д., Чен Ф., Капаноглу Э. Взаимодействие между полифенолами и кишечной микробиотой и влияние на биодоступность. Питательные вещества. 2016; 8 (2): 78. pmid: 26861391; PubMed Central PMCID: PMC4772042.
36. 36. Heller J, Tudzynski P. Активные формы кислорода в фитопатогенных грибах: передача сигналов, развитие и болезнь. Анну Рев Фитопатол. 2011; 49: 369–90. pmid: 21568704.
37. 37.Торрес М.А., Джонс Д.Д., Дангл Д.Л. Передача сигналов реактивных форм кислорода в ответ на патогены. Plant Physiol. 2006. 141 (2): 373–8. pmid: 16760490; PubMed Central PMCID: PMC1475467.
38. 38. Ким MJ, Ciani S, Schachtman DP. Пероксидаза способствует выработке АФК во время реакции корней арабидопсиса на дефицит калия. Завод Мол. 2010. 3 (2): 420–7. pmid: 20139158.
39. 39. Чой Х.В., Ким Й.Дж., Ли СК, Хонг Дж.К., Хван Б.К. Выработка перекиси водорода внеклеточной пероксидазой перца CaPO2 активирует локальную и системную гибель клеток и защитный ответ от бактериальных патогенов.Plant Physiol. 2007. 145 (3): 890–904. pmid: 17
    2; PubMed Central PMCID: PMC2048806.
40. 40. Ван Н., Лю М., Го Л., Ян X, Цю Д. Новый элиситор белка (PeBA1) из Bacillus amyloliquefaciens NC6 вызывает системную резистентность табака. Int J Biol Sci. 2016; 12 (6): 757–67. pmid: 27194952; PubMed Central PMCID: PMC4870718.
41. 41. van Loon LC, Представитель M, Питерс CM. Значение индуцибельных белков, связанных с защитой, у инфицированных растений. Анну Рев Фитопатол.2006; 44: 135–62. pmid: 16602946.
42. 42. Гамир Дж., Дарвиче Р., Вант Хоф П., Чоудхари В., Штумп М., Шнейтер Р. и др. Стеролсвязывающая активность ПРОТЕИНА 1, СВЯЗАННОГО С ПАТОГЕНЕЗОМ, раскрывает механизм действия антимикробного белка. Плант Дж. 2017; 89 (3): 502–9. pmid: 27747953.
43. 43. Печенкова Т., Плескот Р., Зарский В. Субклеточная локализация белка 1 (PR1) Arabidopsis, связанного с патогенезом. Int J Mol Sci. 2017; 18 (4). pmid: 28406455; PubMed Central PMCID: PMC5412409.
44. 44. Сингх А., Лим Г. Х., Качру П. Транспорт химических сигналов в системной приобретенной устойчивости. J Integr Plant Biol. 2017; 59 (5): 336–44. pmid: 28304135.
45. 45. Донг X. NPR1, учитывая все обстоятельства. Curr Opin Plant Biol. 2004. 7 (5): 547–52. pmid: 15337097.
46. 46. Чжоу М., Ван В., Карапетян С., Мвимба М., Маркес Дж., Бюхлер Н. Э. и др. Редокс-ритм усиливает циркадные часы, чтобы блокировать иммунный ответ. Природа. 2015. 523 (7561): 472–6. pmid: 26098366; PubMed Central PMCID: PMC4526266.
47. 47. Умемура К., Огава Н., Ямаути Т., Ивата М., Шимура М., Кога Дж. Цереброзидные элиситоры, обнаруженные в различных фитопатогенах, активируют защитные реакции у растений риса. Physiol растительной клетки. 2000. 41 (6): 676–83. pmid: 10945336.

Модификация развития растений табака посредством смысловой и антисмысловой экспрессии индуцированной вирусом томата протеинкиназы AGC VIIIa PKV предполагает участие в передаче сигналов гиббереллина | BMC Plant Biology