Табака лист: Ошибка 404. Страница не найдена — Объявления на сайте Авито

— струя или распыление для легкого увлажнения и увлажнения вашего любимого цельнолистового табака.

5,75 долл. США

Эти гигантские рулонные бумаги были созданы в Алькой, Испания. Все продукты марки RAW полностью натуральные и бывают разных размеров и стилей, чтобы удовлетворить ваши потребности в прокатке.

4,99 долл. США

Фильтры Gizeh Extra Slim RYO — 5,3 мм, 126 фильтров в коробке. 21 палочка по 6 фильтров.

4,99 долл. США

Фильтры RAW из натурального хлопка. Обычный размер, 200 штук в упаковке.

4,99 долл. США

Новый цельный портсигар в различных цветовых решениях! Вмещает полную пачку сигарет King Sized или Regular.

$ 3,49

Новейший продукт от бренда Skunk может быть первым в своем роде на рынке — конусами из конопляной бумаги американского производства! Этот уникальный на вид продукт сделан в Неваде из конопли, выращенной в США.4 конуса в коробке.

$ 2,99

Металлический складной портсигар. Вмещает сигареты размера King.

2,49 $

Эта бумага изготовлена ​​из небеленой конопли и жевательной резинки высочайшего качества, позволяющей получать ультратонкую, медленно горящую бумагу, которая всегда прилипает. OCB использует только лучшую коноплю, произведенную на полях органической конопли.

2,49 $ | Коробка из 25 буклетов: $ 35,99

Созданная в Alcoy Spain, вся продукция марки RAW полностью натуральна и представлена ​​в различных размерах и стилях, чтобы удовлетворить ваши потребности в прокатке.

2,49 $

Эта бумага изготовлена ​​из небеленой конопли и жевательной резинки высочайшего качества, позволяющей получать ультратонкую, медленно горящую бумагу, которая всегда прилипает. OCB использует только лучшую коноплю, произведенную на полях органической конопли.

2,49 $

Эта бумага изготовлена ​​из небеленой конопли и жевательной резинки высочайшего качества, позволяющей получать ультратонкую, медленно горящую бумагу, которая всегда прилипает. OCB использует только лучшую коноплю, произведенную на полях органической конопли.

2,49 $ | Коробка из 25 буклетов: $ 35,99

Созданная в Alcoy Spain, вся продукция марки RAW полностью натуральна и представлена ​​в различных размерах и стилях, чтобы удовлетворить ваши потребности в прокатке.

1,99 $ | Коробка из 25 буклетов: $ 35,99

Elements Rolling Papers изготовлены из всех натуральных продуктов для максимально чистого курения.

1,99 $ | Коробка из 50 буклетов: 87,99 долл. США

Эта бумага большого формата невероятно популярна и производится одной из старейших компаний в мире.

1,99 $ | Пакет из 5: 8,99 долл. США

Сделано вручную в Америке!

1,49 $ | Коробка из 20 буклетов: $ 23,99

Созданная в Alcoy Spain, вся продукция марки RAW полностью натуральна и представлена ​​в различных размерах и стилях, чтобы удовлетворить ваши потребности в прокатке.

1,49 $

Фильтры премиум-класса ведущего бренда для табака RYO.

1,29 $ | Коробка из 50 буклетов: 50,99 долл. США

Раздел 900 Федерального закона о пищевых продуктах, лекарствах и косметических средствах — Определения

Главная страница Закона о борьбе против табака

Содержание

В этом разделе:

1. Присадка. Термин «добавка» означает любое вещество, предполагаемое использование которого приводит или, как можно разумно ожидать, приведет, прямо или косвенно, к тому, что оно станет компонентом или иным образом повлияет на характеристики любого табачного изделия (включая любые вещества, предназначенные для использования в качестве ароматизатора или красителя или при производстве, производстве, упаковке, переработке, приготовлении, обработке, упаковке, транспортировке или хранении), за исключением того, что этот термин не включает табак или остатки пестицидного химического вещества в необработанном табаке или на нем, или пестицидный химикат.
2. Бренд. Термин «торговая марка» означает разновидность табачных изделий, отличающуюся используемым табаком, содержанием смол, содержанием никотина, используемыми ароматизаторами, размером, фильтрацией, упаковкой, логотипом, зарегистрированным товарным знаком, торговой маркой, идентифицируемым цветным рисунком или любой комбинацией такие атрибуты.
3. Сигарета. Термин «сигарета»
   1. означает продукт, который
      1. — табачное изделие; и
      2. соответствует определению термина «сигарета» в разделе 3 (1) Федерального закона о маркировке и рекламе сигарет; и
   2. включает табак в любой форме, который используется в продукте, который из-за его внешнего вида, типа табака, используемого в наполнителе или его упаковке и маркировке, вероятно, будет предлагаться потребителям или приобретаться ими в качестве сигарету или табак для самостоятельного скручивания.
4. Сигаретный табак. Термин «сигаретный табак» означает любой продукт, состоящий из рассыпного табака, предназначенный для использования потребителями в сигаретах. Если не указано иное, требования, применимые к сигаретам в соответствии с данной главой, также распространяются на сигаретный табак.
5. Торговля. Термин «коммерция» имеет значение, указанное в разделе 3 (2) Федерального закона о маркировке и рекламе сигарет.
6. Табачные изделия контрафактные. Термин «поддельный табачный продукт» означает табачный продукт (или контейнер или этикетку такого продукта), который без разрешения имеет товарный знак, торговое наименование или другой опознавательный знак, отпечаток или устройство или любой их аналог. табачного изделия, указанного в регистрации в соответствии с разделом 905 (i) (1).
7. Дистрибьютор. Термин «дистрибьютор» применительно к табачным изделиям означает любое лицо, которое способствует распространению табачных изделий, как отечественных, так и импортных, в любой точке от первоначального места производства до лица, которое продает или распространяет табачные изделия среди физических лиц в личных целях. потребление.Обычные операторы связи не считаются дистрибьюторами для целей данной главы.
8. Незаконная торговля. Термин «незаконная торговля» означает любую практику или поведение, запрещенные законом, которые связаны с производством, доставкой, получением, владением, распределением, продажей или покупкой табачных изделий, включая любую практику или поведение, направленные на содействие такой деятельности.
9. Индийская страна. Термин «индийская страна» имеет значение, данное этому термину в разделе 1151 раздела 18 Свода законов США.
10. Индейское племя. Термин «индейское племя» имеет значение, данное этому термину в разделе 4 (е) Закона индейцев о самоопределении и помощи в образовании.
11. Сигарочка. Термин «маленькая сигара» означает продукт, который
    1. — табачное изделие; и
    2. соответствует определению термина «маленькая сигара» в разделе 3 (7) Федерального закона о маркировке и рекламе сигарет.
12. Никотин. — Термин «никотин» означает химическое вещество, называемое 3- (1-метил-2-пирролидинил) пиридин или C [10] H [14] N [2], включая любую соль или комплекс никотина.
13. Упаковка. Термин «упаковка» означает пачку, коробку, картон или контейнер любого вида или, если нет другого контейнера, любую упаковку (включая целлофан), в которой табачное изделие предлагается для продажи, продается или иным образом распространяется среди потребителей. .
14. Продавец. Термин «розничный торговец» означает любое физическое, государственное или юридическое лицо, которое продает табачные изделия физическим лицам для личного потребления или управляет предприятием, где разрешена демонстрация табачных изделий в режиме самообслуживания.
15. Сверните табак самостоятельно. Термин «табак для самостоятельного скручивания» означает любой табачный продукт, который в силу своего внешнего вида, типа, упаковки или маркировки подходит для использования и может быть предложен потребителям или приобретен ими в качестве табака для изготовления сигарет. .
16. Мелкий производитель табачных изделий. Термин «небольшой производитель табачных изделий» означает производителя табачных изделий, в котором работает менее 350 сотрудников. Для целей определения количества сотрудников производителя в соответствии с предыдущим предложением считается, что в число сотрудников производителя входят сотрудники каждой организации, которая контролирует, контролируется или находится под общим контролем с таким производителем.
17. Дымовая составляющая. — Термин «компонент дыма» означает любое химическое или химическое соединение в основном или побочном потоке табачного дыма, которое либо переходит из любого компонента сигареты в дым, либо образуется при сгорании или нагревании табака, добавок или других компонентов табачного дыма. табачное изделие.
18. Бездымный табак. Термин «бездымный табак» означает любой табачный продукт, состоящий из измельченного, измельченного, порошкообразного или листового табака и предназначенный для помещения в ротовую или носовую полость.
19. Государственный; территория. Термины «Штат» и «Территория» имеют значение, данное этим терминам в разделе 201.
20. Производитель табачных изделий. Термин «производитель табачных изделий» означает любое лицо, включая любого переупаковщика или перемаркировщика, которое
    1. производит, изготавливает, собирает, обрабатывает или маркирует табачные изделия; или
    2. импортирует готовые табачные изделия для продажи или распространения в США.
21. Табачный склад.
    1. (A) В соответствии с подпунктами (B) и (C) термин «табачный склад» включает любое лицо:
       1. кто
          1. удаляет инородный материал с табачного листа исключительно механическим способом;
          2. увлажняет табачный лист только с помощью питьевой воды в виде пара или тумана; или
          3. очищает от стеблей, сушит и упаковывает табачный лист для хранения и перевозки;
       2. , не совершающий иных действий в отношении табачного листа; и
       3. , который предоставляет любому производителю, которому лицо продает табак, всю информацию, касающуюся действий человека, описанных в пункте (i), которая необходима для соблюдения настоящего Закона.
    2. Термин «табачный склад» исключает любого человека, который
       1. восстанавливает табачный лист;
       2. — производитель, дистрибьютор или продавец табачных изделий; или
       3. применяет к табачному листу любое химическое вещество, добавку или вещество, кроме питьевой воды, в форме пара или тумана.
    3. Определение термина «табачный склад» в подпункте (A) не применяется в той степени, в которой Секретарь определяет посредством нормотворчества, что регулирование в соответствии с этой главой действий, описанных в таком подпункте, подходит для защиты общества. здоровье.
22. США. Термин «Соединенные Штаты» означает 50 штатов Соединенных Штатов Америки и округ Колумбия, Содружество Пуэрто-Рико, Гуам, Виргинские острова, Американское Самоа, остров Уэйк, острова Мидуэй, риф Кингман, атолл Джонстон, Северные Марианские острова и любая другая подопечная территория или владение Соединенных Штатов.

• Текущее содержание с:

  21.06.2018

Бритиш Американ Тобакко — Исследование листьев

Лист исследования

В поисках лучших способов роста

Посредством нашей глобальной науки о листьях и исследований мы разрабатываем новые и инновационные технологии, методы и передовой опыт устойчивого земледелия, которые распространяются среди фермеров в рамках комплексных пакетов поддержки сельского хозяйства.

Наша компания Leaf Science and Research была впервые сформирована в Рио-де-Жанейро в 1974 году и сосредоточена исключительно на новых идеях и способах выполнения вещей, которые могут быть использованы для поддержки наших источников выращивания табака по всему миру. Он включает в себя современные научно-исследовательские лаборатории, селекционные предприятия и партнерские отношения с уважаемыми академическими и исследовательскими учреждениями.

Качественные семена

В рамках нашей программы селекции растений мы разрабатываем новые сорта семян табака, которые обеспечивают более высокий урожай и более высокое качество, а также обладают устойчивостью к болезням.Это помогает повысить устойчивость сельскохозяйственных культур, но не требует каких-либо генетических модификаций. Более 50% табачных листьев, выращиваемых нашими фермерами, производится из наших улучшенных сортов семян, что способствует увеличению урожайности до 20% по сравнению с традиционными сортами.

Мы также работаем над разработкой новых технологий и подходов к выращиванию саженцев табака, которые помогают сократить ручной труд и снизить воздействие на окружающую среду. Например, мы внедрили и расширили «плавающую» систему семенного ложа, основанную на гидропонике, которая сокращает использование воды для выращивания рассады.Это также позволяет более безопасно и эффективно применять агрохимикаты, способствуя значительному сокращению общего использования. Сейчас он используется всеми нашими фермерами в Латинской Америке и внедряется в другие наши операции по выращиванию листьев по всему миру.

Почвенный менеджмент

Чтобы сохранить почву для будущих поколений, мы постоянно работаем над разработкой и применением методов устойчивого управления почвами. Предотвращение потери или деградации почвы имеет решающее значение, и мы внедрили передовые методы и технологии во все операции по выращиванию листьев по всему миру, соответствующие условиям выращивания.К ним относятся минимальная обработка почвы, метод, который сводит к минимуму переворачивание или разрушение почвы; эстафетное земледелие, при котором последовательно выращивают две или более культуры; и использование сидератов на растительной основе.

Управление водными ресурсами также имеет жизненно важное значение для устойчивого ведения сельского хозяйства, особенно с учетом того, что на сельское хозяйство приходится почти 70% забора пресной воды во всем мире и до 90% в некоторых развивающихся странах. В то время как многие табачные культуры являются неорошаемыми, другие, например в Мексике, нуждаются в орошении. Именно в таких ситуациях мы пытаемся найти более устойчивые способы для фермеров поливать свои посевы, одновременно защищая доступ местных сообществ к воде.Например, было показано, что технология капельного орошения повышает эффективность использования воды, а также снижает эрозию почвы и засоление и, в конечном итоге, повышает урожайность.

Есть несколько способов, которыми мы помогаем свести к минимуму использование агрохимикатов на сельскохозяйственных культурах, например, с помощью альтернативных комплексных методов борьбы с вредителями и естественных методов «биоконтроля». У нас также есть стандарты, гарантирующие, что наши фермеры используют только одобренные агрохимикаты с минимально возможной токсичностью в соответствии с классификацией Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ).

Генетически модифицированный (ГМ) лист

Мы изучаем способы использования биотехнологии для улучшения качества табака и изучаем модификации, которые могут помочь в наших усилиях по созданию потенциально менее вредных продуктов.

Мы уважаем озабоченность потребителей, выраженную в отношении генетической модификации сельскохозяйственных культур. Наша текущая политика заключается в том, что мы не используем генетически модифицированный (ГМ) табак ни в одной из наших продуктов и принимаем все разумные меры предосторожности, чтобы избежать его покупки.

В будущем мы полагаем, что генетическая модификация табачного листа может принести пользу с точки зрения повышения качества и консистенции, а также сокращения использования агрохимикатов. Мы продолжаем тщательно оценивать потенциальные выгоды, сбалансированные с возможными последствиями ГМ-культур для окружающей среды.

Forbo Tobacco Leaf 3235 MCT (плитка из мармолеума) 13 дюймов x 13 дюймов

Forbo Tobacco Leaf 3235 MCT Essentials (плитка из мармолеума) 13 дюймов x 13 дюймов

Конструкция: Marmoleum® Composition Tile (MCT) представляет собой однородное напольное покрытие, изготовленное из натуральных ингредиентов, включая льняное масло, канифольные связующие, древесную муку, известняк и сухие пигменты, которые смешиваются, а затем наносятся на полиэфирную основу для обеспечения оптимальной стабильности размеров. .Topshield2 ™ — это высококачественная отделка. Его двойная технология двойного слоя, отверждаемая ультрафиолетом, обеспечивает исключительную производительность, а также чистые и яркие цвета, которые сохраняются с течением времени. Topshield2 ™ создает «готовый к использованию» Marmoleum®, который не требует первоначального обслуживания или нанесения полимера. Поверхность можно отремонтировать или обновить в случае аварии или после многих лет интенсивного использования.

Forbo экологически рационально производит высококачественные виниловые и линолеумные напольные покрытия, которые сделают ваш дом уютным.Forbo считает, что напольные покрытия создают комнаты и задают сцену с точки зрения их использования, атмосферы и уровня комфорта, которые они предлагают.

С более чем 65% рынка Forbo является мировым лидером на рынке линолеума, который продолжает оставаться чрезвычайно популярным выбором даже спустя 150 лет.

Линолеум (Marmoleum — торговая марка линолеума Forbo) — это натуральный продукт, изготовленный из возобновляемого сырья, который подлежит строгому контролю. Для его производства используется натуральное сырье — льняное масло, канифоль, древесная мука и известняк, а также джут и пигменты.Полностью натуральный продукт и самое экологически чистое эластичное напольное покрытие на сегодняшний день.

• Размеры: 13 дюймов x 13 дюймов
• Толщина: 2,0 мм (0,080 дюйма)
• 45 штук в коробке
• 53,82 квадратных футов в коробке
• Слой износа: Topshield 2
• Клей:
• Используйте клеи Forbo T 940, Forbo Sustain 885m или Forbo Sustain 1195
• Используйте шпатель с квадратными зубьями 1/16 «x 1/16» x 1/16 «
• Расход: приблизительно 125 квадратных футов / галлон

Жестяная пластина из листьев табака — Biscuit Home

Ваш заказ

Заказы, размещенные в рабочие дни, будут отправлены в течение 5-7 дней.Пожалуйста, напишите на [email protected], если вы хотите ускорить ваш заказ. Если заказ размещен на товар, которого нет в наличии, вы сразу же получите уведомление по электронной почте о предполагаемой дате доставки.

Обработка заказов, размещенных в выходные или праздничные дни, обычно начинается на следующий рабочий день. Праздники и время пиковых продаж могут изменить сроки доставки.

Обратите внимание: если у вас есть особые пожелания или вы торопитесь, звонить никогда не помешает. С нами можно связаться по телефону 713-598-4821 с 10:00 до 18:00 (CT) с понедельника по пятницу.

Тарифы + услуги

Мы рады предложить БЕСПЛАТНУЮ ДОСТАВКУ НА ЗЕМЛЮ для всех заказов на сумму более 250 долларов США в любую точку США.

Biscuit использует ИБП исключительно для всех внутренних заказов. Мы предлагаем 2-дневную доставку, доставку по воздуху на следующий день или бесплатную наземную доставку для всех заказов, отправленных в США.

После отправки UPS Ground может занять 3-5 рабочих дней. Если вы спешите, выберите обслуживание на второй день или на следующий день. * Для доставки на следующий рабочий день убедитесь, что вы разместили заказ до 14:00 по восточноевропейскому стандартному времени для доставки на следующий рабочий день.Бисквит в настоящее время не доставляется за границу.

14-дневный возврат

Мы с радостью примем возврат всех товаров (за исключением товаров с пометкой «Final Sale») в течение 14 дней с момента доставки. Товары должны быть в оригинальной упаковке и иметь все оригинальные бирки.

Любой товар, отмеченный на нашем веб-сайте как «окончательная распродажа», не подлежит возврату, обмену или балансу магазина независимо от его размера. Предметы с пометкой 50% или выше всегда считаются Окончательной продажей.

Нужно вернуть деньги?

Бисквит должен разрешать любой возврат.Убедительно просим вас не отправлять возврат с помощью личной транспортной этикетки.

Запросите у нас этикетку по электронной почте [email protected], чтобы мы могли отследить вашу посылку и сделать ваш возврат быстрее и удобнее.

Когда я получу возмещение?

Убедительно просим вас подождать 15 рабочих дней с момента получения вашей посылки для обработки возврата. В пиковые сезоны время обработки может быть больше.

Ваш возврат будет зачислен на кредитную карту первоначального покупателя или подарочную карту, в зависимости от обстоятельств.

границ | Грибной состав и разнообразие филлосферы табачных листьев при сушке листьев

Введение

Табак (Nicotiana tabacum L.) — это листовое однолетнее пасленовое растение, коммерчески выращиваемое для получения его листьев. Это одна из наиболее широко выращиваемых коммерческих непродовольственных культур в мире (Liu et al., 2017). Листья табака обычно сначала собирают в коммерческих целях, а затем подвергают дымовой сушке в помещении для выпечки (Naidu, 2001). Целью дымовой сушки является получение сушеных листьев с подходящими физическими свойствами и химическим составом (Burton et al., 1988; Morin et al., 2014). Отверждение листьев обычно проходит в три этапа: стадия пожелтения при температуре <45 ° C и относительной влажности более 75%, стадия закрепления цвета при температуре 45-55 ° C и относительной влажности более 35% и стадия сушки стебля с температурой. 55-70 ° C и относительной влажности ниже 30% (Zheng et al., 2017). Во время процесса лечения многие патогены могут атаковать растение, вызывая поражения и гниение листьев табака, включая бактерии, такие как Erwinia carotovora и Bacillus polymyxa (Spurr, 1980), и грибы, такие как Aspergillus , Penicillium , Alternaria и Cladosporium (Welty et al., 1968).

В последнее время гриб Rhizopus oryzae был связан с гнилью табака в Китае (Wang et al., 2016a; Pan et al., 2019). Гриб растет из нижней части средней жилки сидячего листа и распространяется по пластинке, первоначально образуя белый хлопчатобумажный мицелий, переходящий от белого к черному по мере образования спор. При высокой влажности и высоких температурах во время стадии пожелтения листьев гриб может загнить листья в течение первых 48 часов (Kortekamp et al., 2003).Споры патогена остаются жизнеспособными при высоких температурах на стадии сушки стеблей и, таким образом, выживают из года в год в стойле с дымоходом (Gu et al., 2018). Инокулят патогена был обнаружен в свежих листьях табака, собранных в поле, а также в инструментах, используемых в камере для отверждения (Wang H.C. et al., 2017; Wang X. et al., 2017). За последние 5 лет гниль табака была самым серьезным и наиболее распространенным заболеванием, возникающим при сушке табака дымовой сушки в Китае с потерями до 100% (Cai et al., 2019). Кроме того, R. oryzae использовалось для производства ферментов и ферментации (Huang et al., 2015; Yuzbashev et al., 2015), это также болезнь человека (Ibrahim et al., 2010).

Во многих исследованиях изучалась корреляция между микробиомом и болезнями растений, показывающая, что микробиом может подавлять или способствовать заболеванию (Luo et al., 2019; Raza et al., 2019). Об анализе биоразнообразия микробиома филлосферы с помощью OTU (Operational Taxonomic Units) сообщалось при нескольких заболеваниях табака, включая черную голень, коричневую пятнистость и полюсную гниль табака (Chen et al., 2019; Xiang et al., 2019; Лю и др., 2020). Однако исследование Chen et al. (2019) на полюсной гнили исследовали только микробную филлосферу на тканях табака, отобранных в конце стадии сушки стебля, и поэтому неизвестно, происходят ли такие же изменения во время процесса отверждения, когда возникает столбная гниль табака.

Для изучения микробного состава и разнообразия использовалось множество методов. Методы культивирования обычно просты в применении, но требуют много времени и позволяют выявить только <1% микроорганизмов (Gong et al., 2016; Chen et al., 2018). Независимые от культуры методы, особенно высокопроизводительное секвенирование, более чувствительны и надежны для идентификации культивируемых и трудно культивируемых микроорганизмов (Jayawardena et al., 2018; Mboowa et al., 2018). Chen et al. (2019) обнаружили, что состав грибкового сообщества, относительная численность и доминирующий таксон грибов в каждом образце с разным уровнем полюсной гнили были разными. На уровне рода для образца листовой пластинки доминирующим родом был Aspergillus , Myrothecium, Rhodotorula и Fusarium .Для образцов черешков листьев доминантным родом был Aspergillus и Alternaria .

В связи с серьезным повреждением, которое может быть вызвано гнилью табака, важно знать, как микробиом изменяется на листьях табака с гнилью в процессе отверждения. В камере отверждения температура обычно ниже, а относительная влажность обычно выше на больших высотах. Поэтому были выбраны пластинки и черешки табачных листьев на трех разных высотах отверждения во время трех стадий отверждения.Грибной состав и разнообразие филлосферы табачных листьев были проанализированы как методами культурального анализа, так и методами высокопроизводительного секвенирования. Результаты выявляют изменения в грибах, связанных с гнилью листьев в камере для отверждения, предоставляя список сапробов, естественным образом присутствующих во время процесса отверждения, которые могут быть исследованы в будущем как антагонисты для биологической борьбы с гнилью полюсов табака.

Материалы и методы

Условия окружающей среды

Относительная влажность воздуха измерялась гигроскопом.Температуру воздуха, листовой пластинки и черешка измеряли термометром для выпечки. Влажность листовой пластинки и черешка измеряли самописцем гигрометра, а скорость ветра — анемоскопом. Измерения проводились на высоте 2,5 м, 1,75 м и 1 м над уровнем земли в камере выдержки через 42, 94 и 140 ч после сбора урожая (ч / ч).

Участки отбора проб и стратегия отбора проб

В августе 2018 г. в провинции Гуйчжоу (26 ° 36′N, 107 ° 59′E) в Китае для отбора проб был выбран один стойловый сарай с заболеванием полюсной гнилью.Листья собирали из трех различных позиций для отверждения на высоте 2,5 м (верхний), 1,75 м (средний) и 1,0 м (нижний) от уровня земли. Листья N. tabacum сорта Юньян 87 были собраны 7 августа с промыслового поля и помещены в камеру для посола, начиная с 9 августа. На стадиях пожелтения (42 ч / ч), закрепления цвета (94 ч / ч) и сушки стебля (140 ч / ч) случайным образом отбирали образцы по 10 г табачных листьев в верхнем, среднем и нижнем положениях отверждения, а черешки и листовые пластинки подвергали анализу. затем отделился.Для кодирования образцов буква A использовалась для черешков и B для листовой пластинки, за которой следовала цифра 1 для стадии пожелтения, 2 для стадии закрепления цвета и 3 для стадии сушки стебля, а затем, наконец, после 1 для верхней , 2 для среднего и 3 для более низкого положения. Например, A31 был черешком во время стадии сушки стебля в верхнем положении камеры. Было проведено три биологических повтора (таблица 1). Образцы листьев были немедленно доставлены в лабораторию Академии табачных наук Гуйчжоу при температуре 4 ° C перед культивированием или -80 ° C перед высокопроизводительным секвенированием.

Таблица 1. Условия окружающей среды для образцов табака, взятых из камеры вулканизации.

Выделение и молекулярная идентификация грибов, культивируемых на листьях

Культурные грибы были выделены методом разделения тканей (Attitalla et al., 2010). Грибы выделяли на картофельном агаре с декстрозой (PDA), содержащем 20 г глюкозы, 6 г картофельного порошка и 20 г агара на литр дистиллированной воды, или на агаре на основе сложных алкиловых эфиров (AEA), содержащем 5 г дрожжевого экстракта, 6 г NaNO ₃ , 1.5 г KH ₂ PO ₄ , 0,5 г KCl, 0,25 г MgSO ₄ , 20 мл глицерина и 20 г агара на литр дистиллированной воды (Xu et al., 2015).

Кусочки некротизированной ткани черешка и пластинки (5 × 5 мм) стерилизовали 70% этанолом в течение 30 с, затем 10% гипохлоритом натрия (NaOCl) в течение 2 минут, сушили на воздухе и помещали на планшеты с PDA и AEA. Через 5 дней при 28 ° C в темноте гифа была перенесена в новую чашку для очистки. Из пластин выделяли грибы с разным пигментом, скоростью роста и морфологией.Все очищенные грибы хранили на наклонных площадках КПК при 4 ° C.

Для молекулярной идентификации каждого культивируемого изолята внутреннюю транскрибируемую спейсерную область (ITS) рДНК амплифицировали и секвенировали. ПЦР-амплификацию проводили с использованием праймеров ITS1F (5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3 ‘) и ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’). Амплифицированные фрагменты секвенировали и использовали в качестве запроса при поиске BLASTN в базе данных NCBI nr. Для идентификации изолятов использовали совпадения со значениями идентичности выше 98%.

Усиление ITS и высокопроизводительное секвенирование

ДНК симптоматических черешков и пластинок экстрагировали отдельно с помощью набора FastDNA§Spin в соответствии с инструкциями производителя (MP Biomedicals, Санта-Ана, Калифорния, США) и элюировали в конечном объеме 80 мкл. Количество и качество раствора ДНК оценивали с помощью электрофореза в агарозном геле, а концентрацию и чистоту оценивали с помощью NanoDrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США).

ITS рДНК полной длины чистых изолятов грибов амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров ITS5 (5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3 ‘) и ITS2 (5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’). ПЦР проводили в реакциях объемом 30 мкл в трех экземплярах, при этом каждая реакционная пробирка содержала 3 мкл каждого праймера (2 мкМ), 2 мкл матричной ДНК (1 нг / мкл) и 2 × мастер-смесь для высокоточной ПЦР Phusion High-Fidelity с ГХ. Буфер 15 мкл. Были использованы следующие условия ПЦР: 98 ° C в течение 1 минуты, 98 ° C 10 с, 50 ​​° C 30 секунд и 72 ° C 30 секунд в течение 30 циклов, а конечное продление 72 ° C в течение 50 минут.Затем продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 2% агарозном геле, и целевой размер фрагмента (ITS 306 п.н.) очищали с помощью Gene JET (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, США). Образцы ДНК грибов листьев секвенировали в компании Novogen Bioinformatics Technology Co., Тяньцзинь, Китай, используя секвенирование парных концов 250 п.н. на платформе Ion S5 XL (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США).

Высокопроизводительное секвенирование и статистический анализ

Высокопроизводительное секвенирование выполняли с использованием платформы Ion S5 XL в компании Novogen Bioinformatics Technology Co., Пекин, Китай. Сценарий от Novogen Corporation был использован Cutadapt (V1.9.1) для вырезания последовательностей штрих-кода и праймеров. Конвейер UPARSE (v7.0.1001) использовался для анализа операционных таксономических единиц (OTU) и другой биологической информации о последовательностях, полученных из каждого образца. Сходство было установлено на 97%. Аннотации видов были добавлены к репрезентативным последовательностям OTU. Состав сообщества в каждой выборке подсчитывался на уровне царства, типа, класса, порядка, семейства, рода и вида с помощью Unit (v7.2). Корреляционный анализ Спирмена использовался для определения взаимосвязи между экологическим фактором и относительной численностью ключевых видов (Clarke, 2010). После получения результата секвенирования и расчета матрицы OTUs, Qiime (V. 1.9.1) использовался для сравнения сходства с полной выборкой, чтобы проанализировать альфа-разнообразие и вычислить наблюдаемые виды, Chao1, Shannon, Simpson, ACE и Good’s -индексы покрытия. Программное обеспечение R (версия 2.15.3) использовалось для построения кривой разбавления, кривой рангового обилия и накопления видов.Бета-разнообразие как взвешенных, так и невзвешенных ГРП рассчитывалось с помощью программного обеспечения Qiime (версия 1.9.1). Выравнивание последовательностей для локуса ITS проводили с использованием Muscle (версия 3.8.31) (Edgar, 2004). Филогенетический анализ был проведен с помощью FastTree 2 (версия 1.9.1) (Price et al., 2010) с методом максимального правдоподобия (ML). Анализ основных компонентов (PCA) отображался пакетами WGCNA и пакетом ggplot2 в программном обеспечении R (версия 1.9.1). Каждая OTU была назначена в функциональную гильдию с использованием базы данных FUNGuild.

Результаты

Условия окружающей среды

Во время процесса отверждения, когда в камере сушки происходит гниение полюсов табака, относительная влажность снизилась с 84-91,5% до 8,5-22%, влажность пластинки снизилась с 63-67% до 4-14%, а влажность черешка снизилась с 73- От 78% до 5-20% (таблица 1). Напротив, температура воздуха увеличилась с 37-38 до 67-68 ° C, а температура пластинки увеличилась с 35-36 до 65-66 ° C. Скорость ветра была выше только на этапе закрепления цвета. Это показывает, что ткани сохнут с повышением температуры с течением времени.Положение в камере коррелировало с относительной влажностью, постепенно снижаясь с 91,5 до 84%, от 73 до 57% и от 22 до 8,5% на стадиях пожелтения, фиксации цвета и отверждения при сушке стебля, соответственно. Напротив, температура воздуха постепенно повышалась с 37 до 38 ° C, от 47 до 48 ° C и от 67 до 68 ° C на стадиях отверждения на стадии пожелтения, фиксации цвета и сушки стебля соответственно.

Культурное разнообразие и изобилие грибов

Методом тканевой изоляции было получено 108 изолятов грибов, принадлежащих к 6 родам (таблица 2).Последовательность каждого изолята депонирована в NCBI GenBank. На КПК было выделено больше видов ( Rhizopus oryzae , Epicoccum sp., Diaporthe sp., Aspergillus sp., Alternaria sp.), Чем на AEA ( R. oryzae c, ., Cladosporium tenuissimum , Aspergillus sp.). Наиболее многочисленным видом был R. oryzae , включающий 33 из 54 изолятов на КПК и 35 из 54 изолятов на AEA, за которыми следовало Aspergillus sp.с 18 изолятов на PDA и 15 изолятов на AEA. Наиболее редкими родами были Epicoccum sp., Diaporthe sp., Alternaria sp. и C. tenuissimum .

Таблица 2. Молекулярная идентификация всех листовых грибов, выделенных из черешков и пластинок табака в пекарной камере, где произошла гниль табака.

При анализе для стадии отверждения, объединяющей образцы листовой пластинки и черешка, разнообразие было самым высоким на стадии закрепления цвета для 6 родов и самым низким на стадии отверждения сушки стебля для 2 родов (Таблица 2).Относительная численность (% изолятов вида от общего числа изолятов) на стадии отверждения от пожелтения показала, что R. oryzae были наиболее многочисленными (12,04% на AEA и 13,89% на PDA) во время фиксации цвета. Этап показал, что Aspergillus sp. (9,26% на AEA и 12,96% на PDA) были наиболее многочисленными, а на стадии сушки стебля было обнаружено R. oryzae (16,67% на AEA и 15,74% на PDA). Изоляты C. tenuissimum (1.85% на AEA и 0% на КПК), Epicoccum sp. (1,85% на AEA и 0,93% на КПК) и Diaporthe sp. (0,93% для AEA и 0% для КПК) были обнаружены только на стадии закрепления цвета.

При анализе типа ткани, сочетающего стадии отверждения, разнообразие было самым высоким для листовой пластинки с 5 родами по сравнению с черешками с 4 родами (Таблица 2). Относительная численность показала, что Aspergillus sp. были выше как на черешке (8,33% на AEA и 8,33% на PDA), так и на листовой пластине (5.56% для AEA и 8,33% для PDA), тогда как R. oryzae был самым высоким как для черешка (14,81% для AEA и 15,74% для PDA), так и для листовой пластинки (17,59% для AEA и 14,81% для PDA).

Разнообразие грибов на основе последовательностей

Всего было обнаружено 4 373 082 высококачественных последовательности в 27 образцах черешка и 27 пластинчатых пластинках. После удаления низкокачественных, химерных и редких последовательностей было получено в общей сложности 2238 OTU с идентичностью ≥97% нуклеотидов из 54 образцов, в результате чего среднее количество последовательностей на образец составило 80 983.Последовательность каждого образца была депонирована в базе данных SRA под номером PRJNA634435. Когда количество последовательностей достигло примерно 40 000, кривые разрежения для всех 54 образцов показали, что они приблизились к фазе плато (рис. 1), что свидетельствует о достаточном охвате последовательностей для описания состава грибов.

Рис. 1. Кривые разрежения OTU в различных образцах табачных листьев.

Сравнение между стадиями отверждения показало, что общее количество OTU прогрессивно увеличивалось со значительно большим количеством OTU на стадии сушки стебля, чем на стадии пожелтения (Таблица 3).Для черешков количество ОТЕ увеличивалось между стадиями отверждения, при этом между стадией пожелтения и стадией сушки стебля были существенные различия. Для листовых пластинок количество OTU увеличивалось между стадиями отверждения, со значительными различиями между стадией пожелтения и стадией сушки стебля.

Таблица 3. Индексы альфа-разнообразия грибного сообщества и числа OTU на основе высокопроизводительного секвенирования в различных образцах.

Сравнение позиций показало, что во время стадии пожелтения количество OTU для черешков существенно не различалось, но количество OTU для листовых пластинок было значительно больше в верхнем положении, чем в нижнем (Таблица 3).Во время стадии закрепления цвета было значительно больше OTU в середине по сравнению с верхним положением для черешков, но не было значительных различий для листовой пластинки. Во время стадии сушки стебля не было обнаружено значительных различий для черешков в зависимости от положения, но были значительно более низкие числа OTU в верхнем и среднем положениях по сравнению с нижним положением для листовой пластинки (Таблица 3).

Оперативные таксономические единицы на черешках на стадии сушки стебля и на пластинке на стадии сушки стебля, независимо от положения, имели наибольшее разнообразие на основе средних значений Шеннона, Симпсона, Chao1 и ACE (Таблица 3).Следующее по величине разнообразие OTU было на стадии фиксации цвета как для образцов черешка, так и для образцов листовой пластинки, независимо от положения на основе средних значений Шеннона, Симпсона, Chao1 и ACE. Самые низкие значения индекса разнообразия были обнаружены для OTU на стадии пожелтения как для образцов черешка, так и для образцов листовой пластинки, независимо от положения на основе всех четырех индексов разнообразия.

Таксономический состав OTU

Распределение типов для OTU показало, что 88,29% чистых считываний последовательностей можно отнести к Ascomycota, Basidiomycota, Mucoromycota, Glomeromycota, Mortierellomycota, Blastocladiomycota, Olpidiomycota и Chytridiomycota.Члены других типов не были назначены и, вероятно, не были настоящими грибами (рис. 2). В грибных сообществах преобладали Ascomycota (47,36%), за ними следуют Basidiomycota (5,88%) и Mucoromycota (0,60%). В совокупности Glomeromycota, Mortierellomycota, Blastocladiomycota, Olpidiomycota и Chytridiomycota составили только 0,01% считываний.

Рис. 2. Относительная численность различных образцов на уровне филума. Обилие различных типов бактерий в восемнадцати образцах.Численность была представлена ​​в виде процента от общих эффективных последовательностей грибов в каждом образце. Были показаны десять наиболее распространенных таксонов.

С учетом положения и типа ткани среднее количество считываний на стадию отверждения для Ascomycota составило 56,10%, 47,17%, 38,80% на стадии пожелтения, стадии фиксации цвета и стадии сушки стебля, соответственно, что указывает на снижение по мере того, как отверждение произошло. . Напротив, относительная численность для всех образцов Basidomycota составляла 4,12%, 7,11% и 6%.41% на стадии пожелтения, закрепления цвета и стадии сушки стебля, соответственно, что указывает на пик на стадии закрепления цвета. Относительная численность для всех образцов Mucoromycota составляла 1,01%, 0,15%, 0,65% на стадии пожелтения, стадии фиксации цвета и стадии сушки стебля, соответственно, что указывает на снижение во время отверждения. Комбинируя положение и стадию лечения, относительное количество образцов на основе типа ткани показало, что Ascomycota составляла 46,68% и 48,03%, Basidiomycota составляла 5,57% и 6,18%, а Mucoromycota составляла 0.96% и 0,24% для черешков и пластинки, соответственно, что указывает на отсутствие существенной разницы в зависимости от типа ткани.

На уровне ОТЕ различия между сообществами из образцов черешка и листовой пластинки на разных стадиях отверждения были изображены с помощью диаграмм Венна. Всего на стадии пожелтения было обнаружено 1023 OTU, из которых 40,18% были общими OTU (Рисунок 3). Образцы черешка из верхнего положения и образцы пластинки из среднего положения содержали больше разновидностей грибов (602 и 547 OTU, соответственно), чем другие четыре образца, как показано на рисунке 3А.Всего на стадии фиксации цвета было обнаружено 954 OTU, и 47,80% из них были общими OTU (рис. 3B). Образцы черешка из верхнего положения и образцы пластинки из нижнего положения содержали больше разновидностей грибов (585 и 575 OTU), чем другие четыре образца, как показано на рисунке 3B. Для сравнения, всего 1028 OTU были обнаружены на стадии выделения, и 51,85% из них были общими OTU (рис. 3C). Образцы черешка из среднего положения и образцы листовой пластинки из среднего положения содержали больше разновидностей грибов (645 и 636 OTU, соответственно), чем другие четыре образца, как показано на рисунке 3C.

Рис. 3. Диаграмма Венна, показывающая количество грибковых OTU, обнаруженных в различных тканях табачного листа на трех разных стадиях отверждения. Панели (A – C) , показывающие диаграмму на стадии пожелтения, закрепления цвета и сушки стебля, соответственно. Цифры в разделе керна указывают общие OTU для каждого образца на стадии отверждения. Числа в перекрывающейся области указывают уникальные OTU для двух соседних выборок. Числа в неперекрывающихся регионах указывают уникальные OTU для выборки.

Всего на уровне родов можно классифицировать 35,97% OTU. 30 наиболее распространенных родов показаны на рисунке 4. Среди них 10 наибольшее количество считываний были для Alternaria , Phoma , Cercospora , Aspergillus , Cladosporium , Symmetrospora , Boeremia. Stagonosporopsis , Epicoccum и Hannaella . Однако Rhizopus , который будет включать возбудителя полюсной гнили, R.oryzae , имел только 0,60% чтений. Таким образом, в считывании преобладали ОТЕ для сапрофитных, а не патогенных грибов.

Рис. 4. Относительная численность различных образцов на уровне рода. Обилие бактерий разных родов в восемнадцати образцах. Численность была представлена ​​в виде процента от общих эффективных последовательностей грибов в каждом образце. Были показаны первые тридцать наиболее распространенных таксонов.

Древо максимального правдоподобия 100 наиболее распространенных родов грибов показало, что наиболее доминирующие грибы были в Ascomycota, за ними следовали Basidiomycota, а наименее распространенные грибы были в Mucoromycota (рис. 5).Для Ascomycota преобладающими родами были Alternaria , Aspergillus , Cerospora , Cladosporium , Phoma , Boeremia , Golovinomyces cumocumopsis и Stagonosporopsis. Для Basidiomycota доминантными родами были Symmetrospora , Hannaella , Golubevia и Rhodotorula . Для Mucoromycota доминантным родом был Rhizopus , который будет включать R.oryzae .

Рис. 5. Дерево максимального правдоподобия для 100 наиболее распространенных видов грибов в восемнадцати группах образцов табака дымовой сушки, полученных путем анализа данных пиросеквенирования ITS рДНК. Розовая и синяя части цветовой гаммы представляли роды Ascomycota и Basidiomycota соответственно. Гистограмма с цветовой кодировкой показывала распределение каждого рода грибов в различных образцах.

Обилие первых 10 родов значительно варьировалось в выборках (Таблица 4). Alternaria была наивысшей на уровне B21, за ней следовали A31 и A21, что указывает на то, что она чаще встречается в верхнем положении и несколько чаще встречается на черешке, чем на пластинке. Phoma был самым высоким на уровне B13, за ним следовали A12 и B11, что указывает на то, что он также благоприятствовал во время стадии пожелтения листьев. Беремия была наиболее распространена в B1, за ней следовали B23 и B13, что указывает на то, что она наиболее распространена для пластинки, стадии или положения отверждения. Cercospora была наиболее распространенной B31, за ней следовали B22 и A22, что указывает на то, что она чаще встречается в верхнем положении и несколько чаще встречается на черешке, чем на пластинке. Aspergillus был наиболее распространен в A32, B32 и A33, что указывает на то, что стадия сушки стебля в среднем и нижнем положениях благоприятствовала ему. Rhizopus был самым доминирующим родом в A11, B32 и A31, что указывает на то, что он наиболее часто встречается на черешках во время стадии пожелтения.

Таблица 4. Топ-10 доминирующих таксонов и их относительная численность в грибном сообществе выборки (относительная численность%).

Связь с параметрами окружающей среды

Корреляционный анализ Спирмена для наиболее распространенных родов был проведен между температурой воздуха, относительной влажностью, стадией отверждения, положением, скоростью ветра и влажностью листа и черешка (рис. 6).Температура воздуха существенно повлияла на численность головиномицетов. Относительная влажность существенно повлияла на численность Alternaria , Phoma , Trichoderma , Leptosphaerulina , Gibellulopsis и Candida . Стадия лечения существенно повлияла на численность Golovinomyces , Golubevia , Strelitziana , Dioszegia и Pestalotiopsis . Расположение образца существенно повлияло на численность Alternaria , Aspergillus , Rhizopus и Leptosphaerulina .Скорость ветра существенно повлияла на численность Golovinomyces , Golubevia , Septoriella , Strelitziana , Dioszegia и Pestalotiopsis . Влажность листа и черешка существенно повлияла на численность Alternaria , Stagonosporopsis , Trichoderma , Leptosphaerulina , Gibellulopsis и Candida . В целом, роды Alternaria , Phoma , Golovinomyces , Strelitziana , Leptosphaerulina и Pestalotiopsis были наиболее подвержены влиянию факторов окружающей среды. Rhizopus , который будет включать возбудителя полюсной гнили R. oryzae , был единственным, на который существенно повлияло положение.

Рис. 6. Тепловая карта корреляционного анализа Спирмена . Корреляция Спирмена между основным родом и относительной численностью факторов окружающей среды. Время выпекания (H), температура по влажному термометру (T1), температура по сухому термометру (T2), высота развешивания табака (HT), скорость ветра (W), комнатная температура (RH), влажность листа (L) и черешок влажность (P).«*» И «**» означают p <0,05 и p <0,01, соответственно.

Пространственное распределение микробных сообществ