Афзал рафиқов: Афзал Рафиков

Наталья 904 a Департамент окружающей среды и гигиены труда, Университет Питтсбурга, Питтсбург, Пенсильвания, 15219, США

^c Центр здоровья свободных радикалов и антиоксидантов, Университет Питтсбурга, Питтсбург, Пенсильвания, 15219, США

Эшли Глумак

^a Департамент окружающей среды и гигиены труда, Университет Питтсбурга, Питтсбург, Пенсильвания, 15219, США

^c Центр здоровья свободных радикалов и антиоксидантов, Университет Питтсбурга, Питтсбург, P A, 15219, USA

Руслан Рафиков

^a Департамент окружающей среды и гигиены труда, Университет Питтсбурга, Питтсбург, Пенсильвания, 15219, США

^c Центр здоровья свободных радикалов и антиоксидантов, Университет Питтсбурга, Питтсбург , PA, 15219, USA

Jianfei Jiang

^a Департамент окружающей среды и гигиены труда, Университет Питтсбурга, Питтсбург, Пенсильвания, 15219, США

^c Центр здоровья свободных радикалов и антиоксидантов, Университет Питтсбурга, Питтсбург, Пенсильвания, 15219, США

Джоэл С.Гринбергер

^d Департамент радиационной онкологии, Университет Питтсбурга, Питтсбург, Пенсильвания, 15260, США

Валериан Э. Каган

^a Департамент гигиены окружающей среды и гигиены труда, Университет Питтсбурга, Питтсбург, США, 15219

^c Центр свободных радикалов и антиоксидантов, Университет Питтсбурга, Питтсбург, Пенсильвания, 15219, США

Хюля Байир

^b Отделение интенсивной терапии, Университет Питтсбурга, Питтсбург, США

^c Центр здоровья свободных радикалов и антиоксидантов, Университет Питтсбурга, Питтсбург, Пенсильвания, 15219, США

^a Департамент окружающей среды и гигиены труда, Университет Питтсбурга, Питтсбург, Пенсильвания, 15219, США

^b Отделение интенсивной терапии, Питтсбургский университет, Питтсбург, Пенсильвания 15201, США

^c Центр свободных радикалов и Антиоксидантное здоровье, Университет Питтсбурга, Питтсбург, Пенсильвания, 15219, США

^d Отделение радиационной онкологии, Университет Питтсбурга, Питтсбург, Пенсильвания, 15260, США

^# Равный вклад

Abstract

Супероксиддисмутаза марганца (MnSOD) жизненно важна для защиты митохондрий и клеток от окислительного стресса. Ранее мы продемонстрировали, что каталитически активный гомотетрамер MnSOD может быть стабилизирован окислительным сшиванием. Здесь мы сообщаем, что этот эффект может быть переведен в повышенную радиорезистентность эмбриональных клеток мыши (MEC) за счет предварительного воздействия окислительного стресса.Предварительная обработка МЭК антимицином А, ротеноном или Н ₂ O ₂ увеличивала их выживаемость после облучения. Используя миРНК MnSOD, мы показали, что MEC со сниженными уровнями MnSOD проявляют пониженную способность к прекондиционированию. Таким образом, окислительное прекондиционирование можно использовать для целенаправленной регуляции MnSOD.

Ключевые слова: апоптоз , MnSOD, облучение, прекондиционирование, АФК

Введение

Повреждение митохондрий, реализуемое через супероксид-зависимые пути, играет решающую роль в лучевом поражении клеток и тканей [1].Эти эффекты супероксида и других реактивных форм кислорода, производных супероксида, на митохондрии могут быть реализованы немедленно из-за радиолиза воды, индуцированного облучением (ИК), а также на более позднем этапе митохондриальной стадии апоптотического ответа [2]. Супероксиддисмутаза марганца (MnSOD) обеспечивает первую линию защиты от избыточного образования супероксида в митохондриях [3]. Пострадиационное образование активных форм кислорода и азота, вероятно, связанное с образованием пероксинитрита, может привести к инактивации MnSOD [4].Примечательно, что MnSOD, ограниченный митохондриями, но не MnSOD, генетически модифицированный для попадания в цитозоль, является радиозащитным [5]. Более того, было показано, что лечение плазмидой MnSOD улучшает выживаемость мышей, подвергшихся полному облучению тела (9,5 Гр) [6].

Адаптивный ответ или предварительное кондиционирование, позволяющее избежать летальных эффектов радиационного воздействия, наблюдали в исследованиях выживаемости клеток от дрожжей до клеток млекопитающих и человека in vitro , а также на моделях животных in vivo [7].Точные механизмы, с помощью которых происходит предварительное кондиционирование, неизвестны. Недавно мы показали, что обработка рекомбинантного человеческого (rh) MnSOD окислителями (перекись водорода (H ₂ O ₂ ) плюс пероксидаза хрена или Cu ²⁺ ) индуцировала образование сшитого дитирозином высокомолекулярного весовые олигомеры с интактной активностью и повышенной устойчивостью к разворачиванию, деградации и инактивации, опосредованной пероксинитритом [8]. На основании этого мы предположили, что окислительная модификация MnSOD представляет собой новую стратегию радиозащиты, которая может быть реализована в парадигме прекондиционирования.Здесь мы показываем, что кратковременная предварительная обработка клеток прооксидантными ингибиторами митохондриальных комплексов I и III — ротеноном или антимицином A (AA) — вызывала защиту от гибели клеток, индуцированной IR. Мы также демонстрируем участие окислительной модификации MnSOD в защитном эффекте.

Материалы и методы

Реагенты

Набор для обнаружения апоптоза Аннексина-V был приобретен у BioVision (Маунтин-Вью, Калифорния). Набор активности каспазы-3/7 был получен от Promega (Мэдисон, Висконсин).siRNA и реагенты для трансфекции были от Invitrogen (Карлсбад, Калифорния). Другие реагенты были приобретены у Sigma (Сент-Луис, Миссури).

Культура клеток

Эмбриональные клетки мыши (MECs, любезно предоставлены доктором X. Ванга, Техасский университет, Даллас) культивировали в среде DMEM с добавлением 15% фетальной бычьей сыворотки, 25 мМ HEPES, 50 мг / л уридина, 110 мг. / Л пирувата, 2 мМ глутамина, 1 × незаменимых аминокислот, 0,05 мМ β-меркаптоэтанола, 0,5 × 10 ⁶ Ед / л фактора ингибирования лейкемии мышей, 100 Ед / л пенициллина и 100 мкг / л стрептомицина.

Обработка и облучение

Клетки (0,5–2 × 10 ⁵ ) высевали в чашки для культивирования клеток диаметром 35 или 60 мм и оставляли для прикрепления на ночь. Клетки инкубировали с AA, ротеноном или H ₂ O ₂ в полной культуральной среде перед ИК (30 мин) и подвергали γ-облучению с использованием облучателя Shepherd model 143-45A (JL Shepherd & Associates, Сан-Фернандо, Калифорния) при мощность дозы 4Гр / мин. Затем клетки дважды промывали и среду заменяли свежей.

Активность каспазы в клеточных лизатах измеряли с помощью набора для анализа Caspase-Glo-3/7.Хемилюминесценцию определяли при 25 ° C с помощью планшет-ридера ML1000 (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA), и активность выражали как интенсивность люминесценции на миллиграмм белка, продуцируемого в течение 1 часа инкубации.

Жизнеспособность клеток определяли с иодидом пропидия (PI). Для оценки экстернализации фосфатидилсерина (PS) использовали аннексин V – FITC (плюс PI). Оба измерения были выполнены на проточном цитометре FACScan (Beckton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Экстернализацию PS оценивали как сумму клеток аннексина V (+) с клетками PI (-) и PI (+).

Морфология клеток

МЭК выращивали на покрытых коллагеном стеклянных покровных стеклах перед обработкой АА и ИК. Через 48 часов после облучения клетки фиксировали параформальдегидом (4%), окрашивали Hoechst3343 (2 мкг / мл) в течение 15 минут с последующей флуоресцентной микроскопией и микроскопией в видимом свете для визуализации морфологических характеристик, связанных с апоптозными клетками, включая пузырьки, разрушение ядер и агрегацию гетерохроматина. [9].

Активность MnSOD

Перед измерениями клетки разрушали ультразвуком в PBS, содержащем коктейль ингибиторов протеаз.Активность MnSOD измеряли с использованием метода восстановления цитохрома c Маккорда и Фридовича [10]. Образцы предварительно инкубировали с 5 мМ KCN в течение 45 минут при комнатной температуре для дезактивации Cu, Zn-SOD.

Зимография MnSOD и вестерн-блоттинг

Клетки собирали и лизировали в буфере RIPA с ингибиторами протеаз на льду в течение 45 минут, центрифугировали при 10 000 g в течение 5 минут и супернатанты собирали для электрофореза. Для зимографии образцы инкубировали в буфере Лэммли, содержащем 1.5% SDS и 100 мМ DTT в течение 15 минут и 30 мкг белка были загружены в 10% нативный гель, и модифицированный метод Beauchamp и Fridovich [11] был использован для визуализации активности SOD. Вкратце, гель тщательно промывали PBS, затем инкубировали с 0,23 мМ нитро-синего тетразолия в течение 15 минут при комнатной температуре. Гель снова промывали 4 × 5 мин в PBS. Наконец, гель вымачивали в темноте в растворе, содержащем 28 мМ TEMED и 2,8 × 10 ^-2 мМ рибофлавина, еще на 15 мин. Затем гель снова промывали, как и раньше, и выставляли на свет.Для вестерн-блот-анализа образцы (20 мкг белка на дорожку) нагревали в течение 5 минут при 100 ° C, подвергали 12% SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану, которую зондировали антителами против MnSOD или актина, а затем — пероксидазой хрена, связанной с обнаружение. Показаны типичные гели, представляющие 3 эксперимента.

Трансфекция миРНК

За день до трансфекции МЭК высевали в питательную среду без антибиотиков так, чтобы они были конфлюэнтными на 30-50% во время трансфекции.Трансфекцию проводили в течение 6 часов. После этого среду удаляли и заменяли нормальной питательной средой.

Статистический анализ

Данные выражены как средние значения ± стандартное отклонение (стандартное отклонение, если указано) по меньшей мере трех экспериментов. Изменения переменных анализировали с помощью парного t-критерия или ANOVA. Различия считали достоверными при p <0,05.

Результаты

Индуцированная облучением гибель клеток и окислительное прекондиционирование МЭК

Оценка выживаемости МЭК через 48 часов после облучения 15 Гр (ИК) по положительности ИП показала, что ИК приводит к гибели клеток примерно на 20% ().Предварительная обработка клеток АК, ингибитором митохондриального комплекса III [12], за 30 мин до ИР значительно уменьшала количество клеток PI (+). Этот эффект зависел от концентрации АК с насыщением 0,5 мкг / мл. Защитный эффект АК был более выражен через 72 ч после ИР (). Один только АК не вызывал значительной цитотоксичности в диапазоне доз 0,05–1,5 мкг / мл; однако АК был токсичен для МЭК в дозах, превышающих 4,5 мкг / мл. Наряду с PI-позитивностью как маркером поздней гибели клеток, мы оценивали IR-индуцированную экстернализацию фосфатидилсерина (PS) с помощью позитивности по аннексину-V.С этой целью мы оценили количество клеток Annexin (+) / PI (-) и AnnexinV (+) / PI (+) как индикаторы раннего и позднего апоптоза, соответственно. Мы обнаружили, что ~ 45–50% МЭК проявляют апоптотический фенотип через 48 часов после ИР ().

Защита МЭК от гибели, вызванной ИР, путем предварительной обработки (за 30 минут до ИР) ингибиторами митохондриальных респираторных комплексов — АК ( A, B ) и ротеноном ( C ). А — Зависимость эффекта прекондиционирования от концентрации АК (0,05-4,5 мкг / мл).Количество PI (+) — клеток измеряли через 48 часов после ИК. B — Временной график ИК-индуцированной гибели клеток (AA, 1,5 мкг / мл). C — Защитный эффект предварительного кондиционирования ротеноном (0,01–100 мкМ, другие условия, как в A ).

Биомаркеры вызванной IR апоптотической гибели клеток (оценка через 48 часов после IR) и защиты с помощью предварительной обработки AA (AA, 1,5 мкг / мл). A — экстернализация PS, оцениваемая по положительности аннексина V в PI (+) и PI (-) клетках. B — Активность каспазы-3/7. C — Апоптотическая морфология.

Предварительная обработка клеток АК (1,5 мкг / мл, 30 мин) значительно снизила количество апоптозных клеток. Этот защитный эффект также наблюдался, когда предварительную обработку АК проводили в течение 2 часов. Однако последующее лечение АК (5 мин или 4 ч после ИР) не дало радиозащиты.

В соответствии с высоким процентом апоптозных клеток, оценки каспазы-3/7 продемонстрировали ~ 7-кратное увеличение ферментативной активности через 48 часов после ИК — эффект, который был значительно снижен предварительной обработкой АК (1.5 мкг / мл, 30 мин) ().

Типичная морфология апоптоза — фрагментация ядра, конденсация хроматина, блеббинг — наблюдалась в ~ 50% облученных клеток (). Предварительная обработка АК (1,5 мкг / мл, 30 мин) ослабляла апоптотический ответ, о чем свидетельствовало значительно уменьшенное количество клеток с характерной апоптотической морфологией (~ 30%).

Мы также использовали ротенон, ингибитор митохондриального комплекса I [13]. Предварительная обработка ротеноном (0,01–10 мкМ, за 30 мин до ИК) была такой же радиозащитной, как и АК.Основываясь на оценке жизнеспособности клеток с помощью ИП, ротенон подавлял гибель клеток, индуцированную ИК, примерно на 30% (). Чтобы подтвердить связь защитного действия митохондриальных респираторных ингибиторов с окислительным стрессом, мы дополнительно оценили влияние кратковременного воздействия H ₂ O ₂ на предварительную подготовку МЭК к облучению в диапазоне от 50 мкМ до 1000 мкМ концентрации окислителя. При концентрациях 500–1000 мкМ прекондиционирующий эффект до облучения 15 Гр был аналогичным (~ 30%, о чем свидетельствует экстернализация ФС).При более низких концентрациях (<500 мкМ) наблюдались легкие, но незначительные защитные эффекты (данные не показаны).

Антимицин А индуцировал увеличение активности MnSOD

Чтобы исследовать возможную связь окислительного прекондиционирования с MnSOD, мы оценили активность фермента до и после обработки МЭК АК. Активность MnSOD контрольных (не обработанных АК) MEC составляла ~ 6U / мг белка (). Через 30 минут лечения АК (1,5 мкг / мл) активность MnSOD увеличилась до ~ 9U / мг белка, а через 4 часа достигла ~ 13U / мг белка [8].Соответственно, анализ вестерн-блоттинга показал, что экспрессия белка MnSOD не увеличивалась после обработки AA (). Зимографию в геле использовали для изучения ассоциации активности MnSOD с мономерными или олигомерными формами фермента (). Обработка АК привела к увеличению активности дисмутазы в тетрамерах и олигомерах с более высокой молекулярной массой (). Не было обнаружено активности MnSOD, соответствующей мономерным формам фермента. В отдельных экспериментах мы подтвердили расположение мономеров и олигомеров вестерн-блоттингом с антителом против MnSOD (данные не показаны).Примечательно, что олигомеры MnSOD не диссоциируют под действием SDS (1,5%) плюс DTT (100 мМ). Когда АК использовался вместе с ингибитором синтеза белка, циклогексимидом (СН, 50 мкМ), также наблюдалось накопление ферментативно активных тетрамеров в зависимости от времени, хотя и на несколько более низком уровне. В этих условиях содержание актина снижалось, что свидетельствует об угнетении синтеза белка.

AA индуцировало повышение активности MnSOD. A — Динамика активности MnSOD в МЭК после предварительной обработки АК (1.5 мкг / мл в указанные моменты времени). Данные выражены в виде средних значений ± SE. B — Вестерн-блоттинг с антителами против MnSOD. C — Зимография в геле лизатов MECs для определения активности MnSOD до и после обработки AA. D — Влияние циклогексимида (CH, 50 мкМ) на ферментативную активность MnSOD. Обратите внимание, что АК (1,5 мкг / мл) вызывал зависящее от времени накопление каталитически активных тетрамеров MnSOD (зимография, верхняя панель) по сравнению с количеством актина (вестерн-блоттинг, нижняя панель).

Роль MnSOD в прекондиционировании облучением

Чтобы определить степень, в которой MnSOD участвует в AA-опосредованном прекондиционировании, мы использовали MnSOD-дефицитные МЭК с использованием подхода миРНК.Через 48 часов обработка siRNA (5-20 нМ) вызывала зависимое от концентрации снижение экспрессии MnSOD (). При концентрации миРНК 15 нМ это сопровождалось снижением активности MnSOD до ~ 60% от контрольных значений (). Обработка миРНК не была токсичной для клеток. Затем МЭК, обедненные MnSOD, подвергались действию АК и облучению. Через два дня после IR (день 4 после обработки siRNA) клетки все еще сохраняли свои низкие уровни MnSOD (данные не показаны). Важно отметить, что AA-зависимый прекондиционирующий эффект против IR был почти полностью устранен в MnSOD-истощенных клетках, что подтверждается оценками экстернализации PS (19).

Влияние миРНК MnSOD на IR-индуцированное прекондиционирование. A — Вестерн-блоттинг с антителом против MnSOD через 48 часов после обработки миРНК (5-20 нМ; SC — скремблированная миРНК). B — Активность MnSOD через 48 часов обработки MnSOD-siRNA или SC-siRNA. C — Предварительное кондиционирование МЭК, обедненных MnSOD. Через 48 часов после обработки миРНК клетки подвергали действию АК (1,5 мкг / мл, 30 минут) и облучали. Экстернализацию PS измеряли через 48 часов после ИК. Данные выражены в виде средних значений ± SE.

Обсуждение

Адаптивный ответ или прекондиционирование — это эволюционно законсервированный процесс, в котором низкая доза стрессового стимула активирует реакции, повышающие устойчивость клетки или организма к стрессу от умеренного до тяжелого [14].В парадигме оксидативного стресса сублетальные или малотоксичные дозы оксидативного стресса вызывают адаптивный ответ, который защищает клетки от дальнейшего поражения вторым, более цитотоксическим воздействием с тем же или подобным повреждающим агентом [15,16].

Предварительная подготовка к облучению в клетках млекопитающих была впервые описана Olivieri et al. [17], которые сообщили, что лимфоциты периферической крови, культивируемые в [H-3] -тимидине, показали ~ 50% снижение частоты хромосомных аберраций после заражения острым, более высокой дозой рентгеновского излучения.Другие исследования показали, что небольшие дозы H ₂ O ₂ вызывают защиту от последующего ионизирующего излучения [18]. Присутствие циклогексимида или бензамида во время этой предварительной обработки ингибировало эффекты прекондиционирования, предполагая, что в их реализации участвовал синтез белка.

MnSOD — один из важнейших ферментов, участвующих в защите от окислительного стресса и радиационных повреждений [3]. Наличие достаточного количества каталитически активного MnSOD имеет решающее значение для защиты.Это связано с тем, что скорость реакции между супероксидом и NO очень высока (1,6 × 10 ¹⁰ M ^-1 с ^-1 ) [19], и она сопоставима со скоростью дисмутации супероксида, катализируемой MnSOD, которая составляет порядка 10 ⁹ M ⁻¹ s ⁻¹ [20]. В прошлом это достигалось увеличением количества MnSOD за счет его повышенной экспрессии, что приводило к защите от IR [1,21,22]. Используя миРНК против мышиного MnSOD, Fan et al. выяснили, что MnSOD вносит вклад в индуцированную низкими дозами адаптивную радиорезистентность, индуцированную инфракрасным излучением [23].Повышенная экспрессия генов MnSOD и каталазы, а также повышенная ферментативная активность также наблюдались у мышей через 23 дня после облучения с низкой мощностью дозы [24].

Недавно роль митохондрий в прекондиционировании была подчеркнута в нескольких публикациях [25,26] (). Среди предложенных митохондриальных механизмов прекондиционирования — биосинтез белка, регуляция ионных каналов и стабилизация пор при переходе проницаемости. В настоящем исследовании мы представляем новую концепцию прекондиционирования, которая реализуется посредством посттрансляционной модификации существующего белка.Наша работа демонстрирует, что предварительная обработка клеток оксидантами приводила к модификации и связанной с ней структурной стабилизации уже экспрессированного MnSOD. Ковалентное поперечное сшивание широко используется в биотехнологии для стабилизации белков против денатурирования [27,28]. В нашей предыдущей работе было установлено, что окислительное сшивание каталитически активного гомотетрамера MnSOD приводит к образованию стабилизированной структуры, которая сохраняет свою каталитическую активность [8]. MnSOD образует замкнутые тетра- и олигомеры с более высокой молекулярной массой через поперечные связи Tyr-Tyr (о чем свидетельствуют флуоресценция дитирозина, вестерн-блот-анализ с антителами против дитирозина и масс-спектрометрия).Тетрамерный белок содержит 9 остатков тирозина на мономер. На близком расстоянии расположены два тирозина — 45 и 166. Tyr45 расположен в домене белка, ответственного за образование тетрамеров MnSOD из двух димеров — тетрамерного интерфейса [29]. С другой стороны, Tyr166 расположен на димерной границе раздела, ответственной за сборку димеров MnSOD из его мономеров. За исключением Tyr45 и Tyr166, нет других тирозинов, которые находятся в непосредственной близости ни к димерному, ни к тетрамерному интерфейсу.Структурная близость остатков тирозина способствует их окислению, а не окислению других аминокислотных остатков, что приводит к образованию дитирозина и сшиванию субъединиц. Примечательно, что эта ковалентная олигомеризация связана с повышенной структурной стабильностью фермента и устойчивостью к инактивации пероксинитритом [8]. Таким образом, ковалентное сшивание MnSOD приводит к общему усилению антиоксидантной защиты. Используя миРНК против MnSOD, мы показали, что этот антиоксидантный фермент вносит вклад в адаптивную защиту, но не отвечает за весь вызванный АА прекондиционирующий эффект.Вероятно, что другие механизмы, такие как активация NF-kB, вызванная окислительным стрессом, разобщение белков, ферменты репарации ДНК, гликолитические ферменты и последующее усиление антиоксидантной и антиапоптотической защиты (например, каталаза, SOD, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза и др.) Bcl-2) также играют роль в защитных эффектах прекондиционирования [25,26,30,31].

Пути прекондиционирования митохондрий.

В наших экспериментах в качестве индукторов окислительного стресса использовали ингибиторы митохондриальных респираторных комплексов I и III — ротенон и АК.Эти ингибиторы являются известными индукторами образования супероксида [12,32]. Мы также использовали H ₂ O ₂ — продукт дисмутации супероксидного радикала — в качестве альтернативного способа индукции окислительной модификации MnSOD. Все эти подходы были связаны со значительным повышением устойчивости к ИР. Примечательно, что химическая модификация и стабилизация MnSOD, зависящая от окислительного стресса, происходила в течение короткого промежутка времени после предварительной обработки (30 мин). Это дает возможность разработать протокол быстрой предварительной подготовки.Оптимизация обработок с предварительным облучением может включать использование агентов с относительно низкой токсичностью. Например, было показано, что кофермент Q, нацеленный на митохондрии, и его гомологи индуцируют продукцию супероксидных радикалов в клетках [33,34].

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами NIH U19-A1068021-01, NS061817, HL70755.

Список сокращений