D tobacco: Табачная лавка — D-Tobacco

Закон о предотвращении курения в семье и борьбе против табака от 2009 г. предоставил Управлению по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) полномочия регулировать табачные изделия, включая упаковку сигарет и графические предупреждающие надписи, запрещая вводящие в заблуждение дескрипторы, такие как светлый и низкий уровень смол, которые передают продукт в быть менее вредным, а также установить стандарты содержания никотина в сигаретах и ​​запретить ароматизаторы в сигаретах.Необходима сильная эмпирическая поддержка для информирования политиков о наиболее подходящих способах защиты общественного здоровья с помощью Закона о борьбе против табака.

Программа по табачным изделиям и коммуникациям в Центре междисциплинарных исследований никотиновой зависимости направлена ​​на проведение тщательных лабораторных исследований на людях, направленных на изучение сложных проблем науки о регулировании табака. Наша цель состоит в том, чтобы лучше понять, как табачные изделия могут быть должным образом проданы на рынок и маркированы, чтобы общественность была должным образом информирована об их рисках, а также охарактеризовать, как модели использования табачных изделий влияют на воздействие никотина и токсинов.

♦ Эндрю Штрассер, Ph.D.

♦ Джозеф Капелла, Ph.D.

♦ Роберт Хорник, Ph.D.

♦ Мелисса Меркинкэвэдж, Ph.D.

♦ Дэн Ромер, Ph.D.

♦ Меган Сэддлсон, Ph.D.

Использование отслеживания взгляда для понимания и повышения эффективности графических предупреждений

Графические предупреждающие надписи доказали свою эффективность в выявлении негативных реакций на курение, увеличении заявленного намерения бросить курить и изменении представлений об опасностях курения.Однако большая часть этого исследования проводилась на уровне населения, когда страны вводили графические предупреждения, и поэтому потенциально затруднялись одновременным повышением налогов и кампаниями в СМИ. Кроме того, это исследование не может определить, какие аспекты графических предупреждающих надписей делают их эффективными. Важным первым шагом в оценке эффективности графической предупреждающей этикетки является демонстрация того, могут ли курильщики правильно вспомнить ее содержание. Ранее мы продемонстрировали, что то, как быстро человек обращается к тексту на этикетке и как долго они задерживаются или просматривают изображение, положительно связаны с правильным воспроизведением графической предупреждающей надписи.

Наши текущие исследования в этой области рандомизируют текущих ежедневных курильщиков по одному типу графических предупреждающих надписей. Участники оценивают отслеживание взгляда во время первоначального воздействия графической предупреждающей этикетки, а затем получают сигареты их собственной марки с такой же графической предупреждающей этикеткой, нанесенной на их пачки. Курильщики находятся под наблюдением в течение следующих 10 дней, посещая лабораторию каждые 3 дня, где они проводят измерения воспоминаний, убеждений в отношении риска, связанного с сигаретами, отношения и намерения бросить курить (последний день), а также отслеживают ежедневное потребление сигарет и топографию курения для изучения изменений. в поведении, связанном с курением, и оценки отслеживания взгляда для изучения моделей просмотра.Результаты этого исследования позволят выявить, какие особенности формата графических предупреждающих надписей делают их эффективными и как просмотр шаблонов влияет на эффективность.

UPENN TCORS: обмен сообщениями о табачных изделиях в сложной коммуникационной среде

Центр науки о регулировании табака UPenn — это грант центра P50, финансируемый FDA / NIH, который исследует сообщения, информацию и дезинформацию, связанные с табаком, которые легко доступны в средствах массовой информации, социальных сетях, в комментариях пользователей и на пачках сигарет. сам.

Коллеги из Школы коммуникации Анненберга проводят исследования информации и дезинформации о табачных изделиях в традиционных и новых средствах массовой информации и о том, как воздействие этой информации меняет убеждения, отношения, намерения и употребление табака; а также изучение «стойкости» убеждений о табачных изделиях и их употреблении на основе дезинформации в социальных сетях и оценка корректирующих вмешательств. Наш проект, основанный на CIRNA, исследует влияние упаковки и маркировки сигарет на убеждения курильщиков, их поведение в отношении курения, курение и воздействие никотина.

Табачная промышленность давно осознала, что упаковка, маркетинг и маркировка могут повлиять на представления курильщиков о марках сигарет и их поведении. Учитывая роль FDA в регулировании маркировки сигарет и возможность обязательного использования простой упаковки для сигарет (коричневого или оливкового цвета), как это делается в некоторых других странах, наш проект исследует влияние изменений цвета упаковки сигарет на представления о продуктах и ​​употребление табака. поведение взрослых постоянных курильщиков. Кроме того, с учетом возможности использования графических предупреждающих этикеток в будущем, вторая цель состоит в том, чтобы понять, как графические предупреждающие надписи по сравнению с текстовыми этикетками смягчают влияние изменений упаковки на эти результаты.

Индивидуальные различия в использовании и вред сигарет с низким содержанием никотина

Снижение содержания никотина в сигаретах может быть разумной стратегией для снижения усиливающих свойств при курении сигарет; однако есть некоторые данные, свидетельствующие об обратном. Эмпирические данные контролируемых исследований, включая работу нашей группы, показывают, что некоторые курильщики компенсируют более низкий выход никотина, выкуривая эти сигареты более интенсивно или выкуривая больше сигарет в день.Существующие сигареты с низким содержанием никотина имеют эластичную конструкцию; хотя во время тестирования курительной машины выход никотина низок, фактическое содержание никотина и его доставка курильщикам эквивалентны обычной сигарете. Сигареты с низким содержанием никотина (LNC) имеют низкое содержание никотина по сравнению с обычными сигаретами, что является отклонением по конструкции от сигарет с низким выходом никотина, доступных в настоящее время на рынке. Однако остаются два важных вопроса: 1) будут ли люди курить сигареты LNC более интенсивно или будут курить больше каждый день, тем самым поддерживая желаемый уровень никотина, и в результате будут продолжать подвергаться значительному воздействию токсинов, и 2) существуют ли подгруппы курильщиков более уязвимы к этому адаптивному курению с LNC и связанным с этим рискам.

В нашем исследовании сигарет LNC изучается, как эти сигареты выкуриваются, когда курильщики переходят с сигарет своей нынешней марки, и влияние, которое этот переход оказывает на воздействие дыма, например, уровни окиси углерода в образцах дыхания, а также уровни никотина и т. Д. биомаркеры, указывающие на количество токсинов в результате использования.

Индивидуальные различия в употреблении и вред от курения маленьких сигар с фильтром

Маленькие сигары, в последнее время выросшие в продажах, могут представлять опасность для здоровья.Во-первых, маленькие сигары значительно дешевле, чем сигареты, и поэтому они, вероятно, будут все чаще использоваться (и в большей степени курильщиками с низким SES), чтобы как можно дешевле получить желаемый уровень никотина. Когда в 2009 году изменились ставки налога на сигары, несколько компаний, производящих сигары, немного увеличили вес маленьких сигар до средней весовой категории, чтобы сохранить благоприятный низкий налог и низкий нормативный средний весовой класс. Во-вторых, предполагаемые риски маленьких сигар, как правило, недооцениваются, и поэтому их можно использовать более интенсивно, что приведет к увеличению воздействия.В-третьих, поскольку доставка никотина в сигареты и маленькие сигары различается (pH дыма, пути всасывания), вполне вероятно, что унаследованные различия в метаболизме никотина могут по-разному влиять на курение и воздействие токсинов. Низкая стоимость и в значительной степени нерегулируемые никотиновые продукты требуют тщательного изучения. FDA может утверждать юрисдикцию в отношении любого табачного изделия, и результаты этого исследования могут предоставить эмпирическую поддержку для этого.

Наше исследование маленьких сигар фокусируется на описании того, как выглядит ежедневное использование привычек курения, а также на изучении того, как выкуривается каждая маленькая сигара.Образцы дыхания, мочи и крови используются для полного изучения воздействия небольшого курения сигар на воздействие табачных токсинов на пользователя. Этот проект также исследует восприятие риска в отношении этого продукта, а также субъективные оценки характеристик продукта и дымоудаления.

Falcone M, Bansal-Travers M, Sanborn PM, Tang KZ, Strasser AA. Осведомленность курильщиков «легких» сигарет об изменениях упаковки сигарет в соответствии с требованиями FDA. Исследования в области санитарного просвещения 2015; 30 (1): 81-86

Штрассер А.А., Ашаре Р.Л., Кауфман М., Тан К.З., Месарос А.С., Блэр И.А. Влияние курения на ментолон, биомаркеры воздействия и субъективные реакции. Биомаркеры эпидемиологии рака и профилактика 2013; 22 (3): 382-389.

Штрассер А.А., Тан KZ, Ромер Д., Джепсон С., Капелла Дж. Графические предупреждающие надписи в рекламе сигарет: шаблоны для воспоминаний и просмотра. Американский журнал профилактической медицины 2012; 43 (1): 41-47.

Штрассер А.А., Ором Х, Тан KZ, Дюмон Р.Л., Капелла Дж. Н., Козловски Л.Т. Информация с графическим расширением улучшает предполагаемый риск курения сигар. Зависимое поведение 2011; 36 (8): 865-869.

Strasser AA, Benowitz NL, Pinto A, Tang KZ, Hecht SS, Carmella SG, Tyndale RF, Lerman C. Соотношение метаболитов никотина позволяет прогнозировать топографию курения и уровень биомаркеров канцерогенов. Биомаркеры эпидемиологии рака и профилактика 2011; 20 (2): 234-238.

Штрассер А.А., Тан KZ, Санборн П.М., Чжоу Дж.Й., Козловски LT. Поведенческая блокировка вентиляционного отверстия фильтра на первой сигарете дня предсказывает, какие курильщики легких сигарет увеличат воздействие дыма из заблокированных вентиляционных отверстий. Клиническая и экспериментальная психофармакология 2009; 176: 405-412.

Штрассер А.А., Тан К.З., Туллер М.Д., Капелла Дж. Н.. Рекламные элементы PREP влияют на представления курильщиков о потенциальном вреде. Контроль над табаком 2008; S1: 32-38.

Штрассер А.А., О’Коннор Р.Дж., Муни М.Э., Вилейто Е.П. Анализ цифровых изображений пятен на сигаретных фильтрах как индикатор компенсирующего курения. Биомаркеры эпидемиологии рака и профилактика 2006; 15 (12): 2565-9.

Штрассер А.А., Малайянди В., Хоффманн Э., Тиндейл Р., Лерман С. Связь генотипа CYP2A6 и топографии курения. Исследования никотина и табака 2007; 9 (4): 511-518.

Штрассер А.А., Лерман К., Санборн П.М., Пикворт В., Фельдман Э.Новые сигареты с низким содержанием никотина вызывают компенсирующее курение и повышенное воздействие угарного газа. Зависимость от наркотиков и алкоголя 2007; 86 (2-3): 294-300.

Штрассер А.А., Ашаре Р.Л., Козловски Л.Т., Пикворт В.Б. Влияние блокирования вентиляционных отверстий и топографии курения на уровень угарного газа у курильщиков. Фармакология, биохимия и поведение 2005; 82 (2): 320-329.

Графические предупреждающие наклейки: журнал Time, графические предупреждающие наклейки о сигаретах лучше запоминаются

Электронные сигареты: New York Times, комната для дебатов

90-кДа фосфолипаза D из табака связывается с микротрубочками и плазматической мембраной | Растительная клетка

Абстрактные

Организация массивов микротрубочек в коре растительной клетки включает взаимодействия с плазматической мембраной, предположительно через белковые мостики.Мы использовали иммунохимию и моноклональное антитело 6G5 против кандидатного мостикового белка, тубулинсвязывающего белка массой 90 кДа (p90) из мембран табака BY-2, чтобы охарактеризовать белок и выделить соответствующий ген. Скрининг библиотеки экспрессии кДНК Arabidopsis с использованием антитела 6G5 дает частичный клон, кодирующий фосфолипазу D (PLD), и полноразмерный ген получают путем секвенирования соответствующего клона метки с экспрессируемой последовательностью. Предсказанный белок из 857 аминокислот содержит активные центры фермента, метаболизирующего фосфолипиды, и Ca ² + -зависимый липид-связывающий домен и идентичен PLDδ Arabidopsis.Две аминокислотные последовательности, полученные деградацией по Эдману р90 табака, идентичны соответствующим сегментам последовательности PLD из табака. Более того, иммунопреципитация с использованием экстрактов антитела 6G5 и белка BY-2 табака давала значительную активность PLD, а активность PLD мембранных белков табака BY-2 была увеличена в 6,7 раза с помощью тубулин-аффинной хроматографии. В анализе совместной седиментации p90 связывает и украшает микротрубочки. При иммунофлуоресцентной микроскопии интактных клеток табака BY-2 или лизированных протопластов p90 совместно локализован с кортикальными микротрубочками, и индуцированное таксолом связывание микротрубочек сопровождалось соответствующей реорганизацией p90.Мечение p90 оставалось вдоль плазматической мембраны, когда микротрубочки деполимеризовались, хотя экстракция детергентом отменяла мечение. Следовательно, p90 является специализированным PLD, который связывается с мембранами и микротрубочками, возможно, передавая гормональные и экологические сигналы цитоскелету микротрубочек.

ВВЕДЕНИЕ

Микротрубочки (МТ), основной компонент цитоскелета растений, участвуют в важных клеточных функциях во время роста и развития (Lloyd, 1991; Cyr, 1994; Cyr and Palevitz, 1995; Kost et al., 1999; Ник, 1999). Перед митозом МТ формируют предпрофазную полосу, которая предсказывает план будущего деления клетки. Впоследствии они перестраиваются в митотическое веретено и, в конечном итоге, в фрагмопласт во время цитокинеза. Во время интерфазы они образуют параллельные упорядоченные массивы на внутренней стороне плазматической мембраны. Параллельная организация вновь осажденных микрофибрилл целлюлозы в клеточной стенке отражает ориентацию межфазного массива MT (Williamson, 1991). Напротив, сеть MT также, как известно, реагирует на изменения в организации клеточной стенки (Fisher and Cyr, 1998).Благодаря их взаимодействию с отложениями целлюлозных микрофибрилл, MTs играют важную роль в направленной экспансии клеток (Gertel and Green, 1977; Giddings and Staehelin, 1991).

Массивы интерфазных МТ в коре клеток отвечают на разнообразные онтогенетические и внеклеточные стимулы. Кортикальные массивы MT обычно меняют свою ориентацию с поперечной на продольную по отношению к оси роста по мере созревания клеток (Laskowski, 1990; Cyr and Palevitz, 1995; Wymer and Lloyd, 1996; Granger and Cyr, 2001).Ранение заставляет MTs в соседних клетках переориентироваться параллельно краям раны (Hush et al., 1990). МТ ориентируются перпендикулярно направлению приложенного механического давления (Hush and General, 1991; Zandomeni and Schopfer, 1994) или электрического поля (Hush and General, 1991; Blackman and General, 1995) и ориентируются параллельно центробежной силе (Wymer et al. ., 1996). В листьях льна, пораженных несовместимым штаммом ржавчины, клетки мезофилла фокусируют свои массивы МТ к точке атаки (Kobayashi et al., 1994). Гормоны растений, включая абсцизовую кислоту, цитокинины, ауксин, этилен и гибберелловую кислоту, вызывают переориентацию межфазных массивов МТ во многих тканях (обзор Shibaoka, 1994), а также воздействие синего или красного света (Nick et al., 1990) .

Кортикальные МТ связаны с плазматической мембраной посредством белковых связей. Электронная микроскопия показала поперечные мостики, соединяющие кортикальные МТ с внутренним листком плазматической мембраны (Gunning and Hardham, 1982; Vesk et al., 1996). Инкубация призраков протопластов с Na ₂ CO ₃ или 0.6 M KCl нарушает связывание кортикальных MTs, что согласуется с присутствием связи MT-мембранный белок (Sonobe and Takahashi, 1994). Переваривание протопластов трипсином и химотрипсином вызывает отслоение кортикальных MTs от плазматической мембраны, указывая тем самым, что трансмембранный белок участвует в закреплении MT (Akashi et al., 1990). Также есть указания на то, что трансмембранные МТ-соединения распространяются на клеточную стенку. Когда клеточная стенка удаляется во время приготовления протопластов, массивы МТ обычно становятся дезорганизованными (Lloyd et al., 1980; Голуэй и Хардхэм, 1986; Симмондс, 1992). Сходным образом MTs в протопластах чувствительны к холоду, но становятся устойчивыми к холоду, когда клеточная стенка регенерируется, это указывает на то, что клеточная стенка стабилизирует MTs посредством трансмембранных белков (Akashi et al., 1990). Более того, добавление экзогенного экстенсина к обработанным холодом протопластам делает MT стабильными, указывая тем самым, что белки клеточной стенки могут модулировать действие этих предполагаемых трансмембранных белков (Akashi et al., 1990).

Интересно, что мутант петунии trapu (Dubois et al., 1996) и мутанты Arabidopsis fass и tonneau (Torres-Ruiz and Jurgens, 1994; Traas et al., 1995) не имеют предпрофазной полосы и имеют дезорганизованные межфазные массивы МТ, хотя они все еще находятся в коре клеток. . Следовательно, механизм прикрепления MT к плазматической мембране и их организация в упорядоченные массивы, вероятно, включает более одного белка связывания.

Мало что известно о белках, ответственных за взаимодействия МТ с плазматической мембраной.Сам тубулин может участвовать, возможно, через гидрофобный домен в молекуле тубулина или опосредованно через взаимодействие с интегральным мембранным белком (Sonesson et al., 1997). Белок, образующий ядро ​​МТ, γ-тубулин, также находится в коре клетки (Liu et al., 1994), и большое количество γ-тубулина связывается с очищенной фракцией плазматической мембраны (Stoppin-Mellet et al., 2000). ). Предполагаемые MT-ассоциированные белки различного размера были выделены из цитозольных фракций растений, хотя только некоторые из них были подробно охарактеризованы.Фактор элонгации-1α, как известно, связывается с МТ кальмодулино-чувствительным образом (Durso and Cyr, 1994; Durso et al., 1996), а изофермент субъединицы p86 фактора инициации эукариот — (iso) 4F способен образовывать регулируя сквозной отжиг MT в растительных клетках (Hugdahl et al., 1995). Шаперонин (Nick et al., 2000), белок теплового шока (Petrasek et al., 1998) и импортин-α (Smith and Raikhel, 1998) также были локализованы в MT в клетках растений. Белок массой 65 кДа из моркови связывает МТ in vitro, сохраняя расстояние между микротрубочками, подобное тому, которое наблюдается в интактных клетках (Chan et al., 1999). Группа соответствующих генов, названная NtMAP65-1 , недавно выделенная из табака, кодирует белок, который локализуется в областях перекрывающихся МТ (Смертенко и др., 2000). Ген Tangled1 кукурузы, который участвует в пространственном контроле цитокинеза, кодирует высокоосновной MT-связывающий белок (Smith et al., 2001), а Arabidopsis AtKTN1 кодирует катанин-подобный белок (Burk et al. , 2001). MOR1, консервативный MT-ассоциированный белок, по-видимому, важен для организации кортикальных MT у Arabidopsis (Whittington et al., 2001). Различные моторные белки МТ были выделены из растений с клонированием ряда гомологов кинезина (Asada and Collings, 1997; Krishnakumar and Oppenheimer, 1999; Barroso et al., 2000; Cai et al., 2000). Однако нет никаких доказательств того, что какой-либо из этих белков взаимодействует с плазматической мембраной.

Marc et al. (1996) выделили несколько тубулин-связывающих белков из клеток табака BY-2. Полипептид массой 90 кДа (p90) был обнаружен в основном в солюбилизированной детергентом микросомальной фракции и колокализован с кортикальными MT, что позволяет предположить, что он является потенциальным кандидатом на связывание MT с плазматической мембраной.Здесь мы показываем, что p90 связывает и украшает МТ in vitro. В протопластах он следует за реорганизацией кортикальных МТ, вызванной таксолом, и остается связанным с плазматической мембраной, даже когда МТ деполимеризованы, хотя его можно удалить последующей экстракцией детергента. Скрининг библиотеки экспрессии кДНК Arabidopsis с использованием моноклонального антитела 6G5 против табачного p90 дал клон, кодирующий фосфолипазу D (PLD), что согласуется с активностью PLD, которую мы обнаружили в иммунопреципитатах белков табака BY-2 с антителом 6G5 и с обогащением PLD. активность после тубулин-аффинной хроматографии мембранных белков.Мы предполагаем, что ассоциированный с мембраной PLD участвует в передаче гормональных сигналов и сигналов окружающей среды в цитоскелет MT.

РЕЗУЛЬТАТЫ

p90 Реагирует с моноклональными антителами 6G5 и 4B5

Рисунок 1.

Обнаружение иммуноблотом p90 в мембранных белках табака BY-2.

Мембранные белки, полученные экстракцией микросомальных фракций клеток табака BY-2 детергентом 3 — ([3-холамидопропил] диметиламино) -1-пропансульфонат (Chaps), разделяли электрофорезом на 8% (мас. / Об.) SDS. –Полиакриламидные гели, перенесенные на нитроцеллюлозную мембрану и зондированные антителами. Дорожка 1: гель, окрашенный кумасси синим; полоса 2, моноклональное антитело против α-тубулина; полоса 3, поликлональная сыворотка против α / β-тубулина сои; полоса 4, пептидная сыворотка против консервативной области γ-тубулина; полоса 5, моноклональное антитело 6G5; полоса 6, моноклональное антитело 4B5; дорожка 7, контроль с использованием предварительно нагретого антитела 6G5.Иммунореакции выявляли щелочной фосфатазой. Стрелка справа указывает положение иммунореактивного полипептида массой 90 кДа (p90). Полоски слева указывают положение стандартов молекулярной массы.

Рисунок 1.

Обнаружение иммуноблотом p90 в мембранных белках табака BY-2.

Мембранные белки, полученные экстракцией микросомальных фракций клеток табака BY-2 детергентом 3 — ([3-холамидопропил] диметиламино) -1-пропансульфонат (Chaps), разделяли электрофорезом на 8% (мас. / Об.) SDS. –Полиакриламидные гели, перенесенные на нитроцеллюлозную мембрану и зондированные антителами.Дорожка 1: гель, окрашенный кумасси синим; полоса 2, моноклональное антитело против α-тубулина; полоса 3, поликлональная сыворотка против α / β-тубулина сои; полоса 4, пептидная сыворотка против консервативной области γ-тубулина; полоса 5, моноклональное антитело 6G5; полоса 6, моноклональное антитело 4B5; дорожка 7, контроль с использованием предварительно нагретого антитела 6G5. Иммунореакции выявляли щелочной фосфатазой. Стрелка справа указывает положение иммунореактивного полипептида массой 90 кДа (p90). Полоски слева указывают положение стандартов молекулярной массы.

Рисунок 2.

p90 Совместно с кортикальными MT в протопластах.

Протопласты табака BY-2 обрабатывали для иммунофлуоресцентной микроскопии с использованием мышиных моноклональных антител 4B5 вместе с кроличьей поликлональной сывороткой против α / β-тубулина сои с последующей смесью конъюгированных с Texas Red антимышиных и флуоресцеиназотиоцианатов (FITC) — конъюгированные вторичные антитела против кролика.

(A) p90, визуализированный с помощью антитела 4B5 и вторичного антитела, конъюгированного с Texas Red.

(B) α / β-Тубулин, визуализированный с помощью сыворотки против тубулина сои и вторичного антитела, конъюгированного с FITC.

Пруток в (B) = 10 мкм для (A) и (B) .

Рисунок 2.

p90 колокализуется с кортикальными МТ в протопластах.

Протопласты табака BY-2 обрабатывали для иммунофлуоресцентной микроскопии с использованием мышиных моноклональных антител 4B5 вместе с кроличьей поликлональной сывороткой против α / β-тубулина сои с последующей смесью конъюгированных с Texas Red антимышиных и флуоресцеиназотиоцианатов (FITC) — конъюгированные вторичные антитела против кролика.

(A) p90, визуализированный с помощью антитела 4B5 и вторичного антитела, конъюгированного с Texas Red.

(B) α / β-Тубулин, визуализированный с помощью сыворотки против тубулина сои и вторичного антитела, конъюгированного с FITC.

Пруток в (B) = 10 мкм для (A) и (B) .

фиг. 7.

Совместная локализация p90 с кортикальными МТ в протопластах сопровождает реорганизацию, индуцированную таксолом.

Протопласты получали из клеток табака BY-2 с предварительной инкубацией или без нее в 10 мкМ таксола и затем обрабатывали для иммунофлуоресцентной микроскопии. Препараты дважды метили с использованием антитела 6G5 вместе с кроличьей сывороткой против α / β-тубулина сои, а затем смесью конъюгированных с Cy3 антимышиных ( [A] и [C] ) и конъюгированных с FITC анти- кроличьи ( [B] и [D] ) вторичные антитела.

(A) и (B) Контрольные протопласты, полученные без таксола.p90 связывается с MT точечно, хотя некоторые пятна появляются в областях, свободных от MT, призрака протопласта (кружки).

(C) и (D) Протопласты с индуцированными таксолом параллельными массивами MT и совпадающими массивами точечных точек p90.

Пруток в (D) = 20 мкм для (A) от до (D) .

Рисунок 7.

Совместная локализация p90 с кортикальными МТ в протопластах сопровождает реорганизацию, индуцированную таксолом.

Протопласты получали из клеток табака BY-2 с предварительной инкубацией или без нее в 10 мкМ таксола и затем обрабатывали для иммунофлуоресцентной микроскопии.Препараты дважды метили с использованием антитела 6G5 вместе с кроличьей сывороткой против α / β-тубулина сои, а затем смесью конъюгированных с Cy3 антимышиных ( [A] и [C] ) и конъюгированных с FITC анти- кроличьи ( [B] и [D] ) вторичные антитела.

(A) и (B) Контрольные протопласты, полученные без таксола. p90 связывается с MT точечно, хотя некоторые пятна появляются в областях, свободных от MT, призрака протопласта (кружки).

(C) и (D) Протопласты с индуцированными таксолом параллельными массивами MT и совпадающими массивами точечных точек p90.

Пруток в (D) = 20 мкм для (A) от до (D) .

Иммуноблоттинг с использованием антитела 6G5 выявляет эпитопы белка, связанного с p90, у других растений и Dictyostelium

Рисунок 3.

p90 присутствует в растениях и низших эукариотах.

Белковые экстракты из растительной ткани и Dictyostelium разделяли на 10% (мас. / Об.) SDS-полиакриламидных гелях (от 10 до 20 мкг белка на дорожку), переносили на нитроцеллюлозную мембрану и зондировали антителом 6G5 с последующим обнаружением щелочной фосфатазы. . Дорожка 1, экстракт табака BY-2 Chaps; дорожка 2 — сеянцы арабидопсиса; переулок 3, Диктиостелиум.Полоски слева указывают положение стандартов молекулярной массы.

Рисунок 3.

p90 присутствует в растениях и низших эукариотах.

Белковые экстракты из растительной ткани и Dictyostelium разделяли на 10% (мас. / Об.) SDS-полиакриламидных гелях (от 10 до 20 мкг белка на дорожку), переносили на нитроцеллюлозную мембрану и зондировали антителом 6G5 с последующим обнаружением щелочной фосфатазы. . Дорожка 1, экстракт табака BY-2 Chaps; дорожка 2 — сеянцы арабидопсиса; переулок 3, Диктиостелиум.Полоски слева указывают положение стандартов молекулярной массы.

Антитело 6G5 обнаруживает PLD из библиотеки экспрессии кДНК Arabidopsis

Рисунок 4.

Выравнивание аминокислотных последовательностей, кодируемых клонами кДНК PLD из Arabidopsis and Tobacco.

Показано выравнивание PLD98 Arabidopsis (AtPLD98) с PLDδ арабидопсиса (AtPLDδ) и частичным клоном кДНК PLD табака (NtPLD), полученным с использованием алгоритма CLUSTAL W (Thompson et al., 1994). Заштрихованные прямоугольники показывают идентичность последовательностей, а пунктирные линии указывают пробелы, введенные для оптимизации выравнивания последовательностей. Предполагаемые функциональные домены обозначены линиями над последовательностями, а именно: C2, Ca ² + -зависимый липид-связывающий домен; pas, активные центры ферментов, метаболизирующих фосфолипиды. Аминокислотная микропоследовательность из табака p90, BY2seq1, высоко гомологична остаткам AtPLD98 с 314 по 328 и идентична соответствующей области в PLD табака.

Рисунок 4.

Выравнивание аминокислотных последовательностей, кодируемых клонами кДНК PLD из Arabidopsis и Tobacco.

Показано выравнивание PLD98 Arabidopsis (AtPLD98) с PLDδ Arabidopsis (AtPLDδ) и частичного клона кДНК PLD табака (NtPLD), полученного с использованием алгоритма CLUSTAL W (Thompson et al., 1994). Заштрихованные прямоугольники показывают идентичность последовательностей, а пунктирные линии указывают пробелы, введенные для оптимизации выравнивания последовательностей. Предполагаемые функциональные домены обозначены линиями над последовательностями, а именно: C2, Ca ² + -зависимый липид-связывающий домен; pas, активные центры ферментов, метаболизирующих фосфолипиды.Аминокислотная микропоследовательность из табака p90, BY2seq1, высоко гомологична остаткам AtPLD98 с 314 по 328 и идентична соответствующей области в PLD табака.

Предсказанный белок AtPLD98 содержит двойной мотив HxKxxxD (HQKCVLVD и HAKGMIVD) на остатках с 362 по 369 и с 707 по 714 (рис. 4), который, как полагают, является активным сайтом ферментов, метаболизирующих фосфолипиды во всех PLD (Ponting and Kerr, 1996; Ван 2000).Остатки 75-107 напоминают Ca ² + -зависимый липид-связывающий домен (фиг. 4, домен C2), присутствующий во всех PLD растений (Wang, 1997, 2000).

Чтобы подтвердить, что мы идентифицировали правильный ген, мы получили две аминокислотные микропоследовательности путем деградации по Эдману исходного табака p90. Последовательность SEGIMGTSDEETRRY очень гомологична аминокислотным остаткам с 314 по 328 в AtPLD98 (рис. 4), а также с другими PLD в базе данных. Более того, последовательность идентична соответствующему сайту из частичного клона PLD из табака (номер доступа в GenBank AAF05818) (фиг. 4, NtPLD).Последовательность IIGTFTGVQENLTI частично гомологична остаткам с 843 по 857 в AtPLD98 (фиг. 4), а также с другими PLD в базе данных; эта последовательность также идентична соответствующему сайту из частичного клона PLD из табака (К. Чепмен, личное сообщение). Следовательно, клон кДНК арабидопсиса, который мы выделили, скорее всего, является правильным геном. Действительно, антитело 6G5 также распознает рекомбинантный белок, экспрессируемый клоном кДНК Arabidopsis (данные не показаны).

Иммунопреципитация белков табака BY-2 антителом 6G5 дает активность PLD

Рисунок 5.

Активность PLD в белках табака BY-2.

Пробы белка инкубировали с реакционной смесью, содержащей флуоресцентный фосфатидилхолин и фосфатидилэтанол, продукты разделяли с помощью тонкослойной хроматографии и измеряли флуоресценцию фосфатидилэтанола с помощью спектрофотометра.

(A) Активность PLD в осадках, подвергшихся иммунопреципитации. Значительную (P <0,01) активность PLD измеряли в гранулах, иммунопреципитированных антителом 6G5 против p90 и вторичным антителом, конъюгированным с агарозой (анти-IgM).Только фоновые уровни активности PLD были обнаружены в осадках, полученных с использованием антител против актина, кальмодулина (CaM) и α-тубулина, а затем вторичных антител, конъюгированных с агарозой (анти-IgG). Данные показывают средние значения ± sem по крайней мере из трех независимых экспериментов для каждой точки.

(B) Активность PLD во фракциях белка BY-2 табака по данным тубулин-аффинной хроматографии. Активность PLD в детергентном (Chaps) экстракте микросом табака BY-2 снижалась на ~ 67% в проточной фракции колонки и повышалась до 6.7-кратное количество связывающих тубулин белков, элюированных 0,3 М NaCl. Данные показывают средние значения ± sem, полученные из одного набора из трех фракций белка, каждая из которых проанализирована с помощью четырех независимых анализов PLD.

Рис. 5.

PLD в белках табака BY-2.

Пробы белка инкубировали с реакционной смесью, содержащей флуоресцентный фосфатидилхолин и фосфатидилэтанол, продукты разделяли с помощью тонкослойной хроматографии и измеряли флуоресценцию фосфатидилэтанола с помощью спектрофотометра.

(A) Активность PLD в осадках, подвергшихся иммунопреципитации. Значительную (P <0,01) активность PLD измеряли в гранулах, иммунопреципитированных антителом 6G5 против p90 и вторичным антителом, конъюгированным с агарозой (анти-IgM). Только фоновые уровни активности PLD были обнаружены в осадках, полученных с использованием антител против актина, кальмодулина (CaM) и α-тубулина, а затем вторичных антител, конъюгированных с агарозой (анти-IgG). Данные показывают средние значения ± sem по крайней мере из трех независимых экспериментов для каждой точки.

(B) Активность PLD во фракциях белка BY-2 табака по данным тубулин-аффинной хроматографии. Активность PLD в детергентном (Chaps) экстракте микросом табака BY-2 снижалась на ~ 67% в проточной фракции колонки и повышалась в 6,7 раза по связыванию тубулина белками, элюируемым 0,3 М NaCl. Данные показывают средние значения ± sem, полученные из одного набора из трех фракций белка, каждая из которых проанализирована с помощью четырех независимых анализов PLD.

Активность PLD в экстрактах табака BY-2 повышена с помощью тубулиновой аффинной хроматографии

Рисунок 6.

p90 Украшает МТ in Vitro.

Таксол-стабилизированные МТ нейронов с экстрактом Chaps (Ex) мембранных белков табака BY-2 и осаждены центрифугированием. Осадок белковые комплексы распределяли на предметных стеклах микроскопа, фиксировали и дважды метили с использованием мышиного моноклонального антитела 6G5 вместе с кроличьей сывороткой против α / β-тубулина сои. с последующей смесью конъюгированных с Cy3 антимышиных ( [A] и [C] ) и FITC-конъюгированных вторичных антител против кроликов ( [B] и [D] ).

(A) и (B) Контрольные MT, инкубированные только в буфере, что свидетельствует об отсутствии мечения антителом 6G5.

(C) и (D) MT, украшенные p90 после инкубации с мембранными белками.

Пруток в (D) = 10 мкм для (A) от до (D) .

Рисунок 6.

p90 Украшает МТ in vitro.

Таксол-стабилизированные нейронные MT инкубировали с экстрактом Chaps (Ex) мембранных белков табака BY-2 и осаждали центрифугированием.Гранулированные белковые комплексы распределяли на предметных стеклах микроскопа, фиксировали и дважды метили с использованием мышиного моноклонального антитела 6G5 вместе с кроличьей сывороткой против α / β-тубулина сои, а затем смесью антимышиных антител, конъюгированных с Cy3 ( [A] и [C] ) и конъюгированных с FITC вторичных антител против кролика ( [B] и [D] ).

(A) и (B) Контрольные MT, инкубированные только в буфере, что свидетельствует об отсутствии мечения антителом 6G5.

(C) и (D) MT, украшенные p90 после инкубации с мембранными белками.

Пруток в (D) = 10 мкм для (A) от до (D) .

p90 из детергентного экстракта мембран табака связывает и украшает MT, стабилизированные таксолом

Белок p90 был первоначально выделен с помощью тубулин-аффинной хроматографии с последующей совместной оседанием с MT, стабилизированными таксолом, и гель-электрофорезом (Marc et al., 1996). Чтобы подтвердить, что p90 действительно связывается с MT, а не осаждается спонтанно во время стадии седиментации, мы проанализировали осажденные белки с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии с использованием двойного мечения с 6G5 и антителами против α / β-тубулина. Иммунофлуоресцентные изображения стабилизированных таксолом нейрональных MT, инкубированных только в буфере, показали многочисленные короткие, тонкие и свободно рассеянные MT, меченные анти-α / β-тубулином, но не антителом 6G5 (Фигуры 6A и 6B). Напротив, после инкубации с мембранными белками МТ были организованы в более толстые, длинные и различные взаимосвязанные пучки, которые были помечены как 6G5, так и антителами против α / β-тубулина (Фигуры 6C и 6D).Таким образом, связанный p90 появляется как украшения MT, указывая на тесную ассоциацию с MT, хотя другие белки из экстракта мембраны могут участвовать в связывании MT.

p90 локализуется в кортикальных МТ, а его распределение модифицируется таксолом

Поскольку p90 был первоначально выделен из микросомальной фракции, включая эндомембраны (Marc et al., 1996), необходимо подтвердить его ассоциацию с клеточной корой. В контрольных протопластах, приготовленных в отсутствие таксола, антитело 6G5 давало точечную маркировку, которая соответствовала маркировке MT против α / β-тубулина (Фигуры 7A и 7B), а также случайным образом распределенные точки в областях, свободных от MT (Фигуры 7А, кружок), что указывает на связь с плазматической мембраной.В протопластах, приготовленных из клеток, которые были предварительно инкубированы с таксолом, МТ образовывали упорядоченные массивы параллельных пучков (рис. 7D), подобные тем, о которых сообщалось ранее (Kuss-Wymer and Cyr, 1992). Тем не менее, ассоциация p90 с MTs сохранялась во время этой реорганизации как точечная метка вдоль MTs (Фигуры 7C и 7D). Следовательно, линейная совместная локализация p90 с кортикальными МТ определяется МТ, а не наоборот.

p90 остается прикрепленным к клеточной коре после удаления MT, но может быть извлечен с помощью детергента

Рисунок 8.

p90 ассоциируется с плазматической мембраной протопласта в отсутствие МТ, но может быть извлечен с помощью детергента.

Протопласты табака BY-2, полученные после предварительной инкубации с 10 мкМ таксола, обрабатывали кальцием и детергентом, а затем обрабатывали для иммунофлуоресцентной микроскопии с использованием двойного мечения антителами против p90 и α / β-тубулина, как показано на рисунке 7.

(A) и (B) Кортикальные МТ были удалены из призраков протопластов обработкой холодом в присутствии 5 мМ CaCl ₂ в течение 30 мин. Тем не менее, многочисленные беспорядочно рассредоточенные точки, меченные антителом 6G5, оставались прикрепленными к плазматической мембране.

(C) и (D) Призраков протопластов дополнительно экстрагировали 0,05% (мас. / Об.) Triton X-100 (TX-100) в течение 10 мин. Эта обработка удалила большую часть метки p90.

Пруток в (D) = 20 мкм для (A) от до (D) .

Рис. 8.

p90 связывается с плазматической мембраной протопласта в отсутствие МТ, но может быть извлечен с помощью детергента.

Протопласты табака BY-2, полученные после предварительной инкубации с 10 мкМ таксола, обрабатывали кальцием и детергентом, а затем обрабатывали для иммунофлуоресцентной микроскопии с использованием двойного мечения антителами против p90 и α / β-тубулина, как показано на Фигуре 7.

( A) и (B) Кортикальные МТ были удалены из призраков протопластов обработкой холодом в присутствии 5 мМ CaCl ₂ в течение 30 мин.Тем не менее, многочисленные беспорядочно рассредоточенные точки, меченные антителом 6G5, оставались прикрепленными к плазматической мембране.

(C) и (D) Призраков протопластов дополнительно экстрагировали 0,05% (мас. / Об.) Triton X-100 (TX-100) в течение 10 мин. Эта обработка удалила большую часть метки p90.

Пруток в (D) = 20 мкм для (A) от до (D) .

p90 колокализуется с массивами MT на протяжении клеточного цикла

Фиг.9.

p90 Колокализуется с МТ-массивами на протяжении всего клеточного цикла.

Клетки табака BY-2 фиксировали и обрабатывали для иммунофлуоресцентной микроскопии с использованием двойного мечения антителами против p90 и α / β-тубулина, как показано на рисунке 7.На всех стадиях клеточного цикла массивы MT были сопоставлены с точечными массивами p90.

(A) и (B) Межфазный кортикальный массив.

(C) и (D) Предпрофазная полоса.

(E) и (F) Метафазный шпиндель.

(G) и (H) Цитокинетический фрагмопласт.

Штанга в (H) = 20 мкм для (A) от до (H) .

Рисунок 9.

p90 Колокализуется с массивами MT на протяжении всего клеточного цикла.

Клетки табака BY-2 фиксировали и обрабатывали для иммунофлуоресцентной микроскопии с использованием двойного мечения антителами против p90 и α / β-тубулина, как показано на фиг.7. На всех стадиях клеточного цикла массивы MT были сопоставлены с точечными массивами стр90.

(A) и (B) Межфазный кортикальный массив.

(C) и (D) Предпрофазная полоса.

(E) и (F) Метафазный шпиндель.

(G) и (H) Цитокинетический фрагмопласт.

Штанга в (H) = 20 мкм для (A) от до (H) .

ОБСУЖДЕНИЕ

Табак p90 представляет собой PLD с иммунологической гомологией и гомологией последовательностей с PLD арабидопсиса

Три линии экспериментальных данных подтверждают мнение о том, что белок p90 табака является PLD. Во-первых, иммунопреципитация белков табака BY-2 антителом 6G5 дает активность PLD.Более того, активность PLD в белках BY-2 табака повышается с помощью тубулин-аффинной хроматографии, параллельно с повышенным количеством p90, обнаруживаемым на иммуноблотах белковых фракций с антителом 6G5. Во-вторых, две аминокислотные последовательности, полученные с помощью микросеквенирования пептидов, точно соответствуют областям полипептида, кодируемого частичным клоном кДНК PLD табака (К. Чепмен, личное сообщение). В-третьих, антитело 6G5 выбрало клон PLD при скрининге библиотеки кДНК Arabidopsis, и оно также реагирует с рекомбинантным белком на иммуноблотах.Размер предсказанного белка AtPLD98 соответствует размеру белка, распознаваемого антителом 6G5 на блотах экстракта белка Arabidopsis. Иммуноблоты белковых экстрактов из другого двудольного растения, двух однодольных растений и Dictyostelium также показали аналогичные иммунореактивные полипептидные полосы, что позволяет предположить, что родственные белки широко распространены в царстве растений и в плесневых грибах. Фосфолипазы A _{, 2,} , C и D регулируют различные процессы у высших растений, включая созревание эмбрионов, прорастание, удлинение клеток, старение, реакции на раны, осмотический стресс и ответы патогенов (обзор Chapman, 1998).PLD, который присутствует в растениях в виде многочисленных изоформ, катализирует гидролиз концевой фосфодиэфирной связи глицерофосфолипидов с образованием фосфатидной кислоты и гидрофильной головной группы, такой как холин (Wang, 1997, 2000). Считается, что он играет важную роль в клеточных процессах, включая генерацию вторичных мессенджеров (Wang, 1999) и деградацию мембран (Paliyath and Droillard, 1992).

Табак р90 связывается с МЦ

Иммунофлуоресцентная микроскопия с антителом 6G5 показала, что табак p90 колокализуется in situ с кортикальными матрицами МТ как в призраках протопластов табака BY-2, так и в препаратах цельных клеток.Эта совместная локализация не является артефактом полиэтилениминового покрытия предметных стекол, потому что в цельноклеточных препаратах p90 все еще связан со шпинделем, фрагмопластом, препрофазной полосой и межфазными МТ, которые отделены от поверхности предметного стекла с помощью материал клеточной стенки. Украшение МТ, наблюдаемое при иммунофлуоресцентной микроскопии, дополнительно демонстрирует его связь с МТ. Кроме того, мы обнаружили, что связывание p90 с MT ингибировалось нагреванием экстракта Chaps до 60-80 ° C (данные не показаны), что указывает на то, что для реакции связывания требуется нативный белок, а не только условное электростатическое притяжение.Хотя pI табака p90 еще не известна (этот клон секвенируется; К. Чепмен, личное сообщение), мы отмечаем, что соответствующий AtPLD98 является нейтральным и, следовательно, вряд ли будет связываться с кислым С-концом тубулина (Fosket and Morejohn). , 1992) электростатическими силами. Природу сайта связывания МТ еще предстоит определить. Поиски сходства последовательностей не выявили области значительной гомологии между известными сайтами связывания MT и PLD Arabidopsis или частично секвенированным PLD табака, хотя это не удивительно, поскольку сайты связывания MT обычно расходятся.

Табак p90 связывается с плазматической мембраной во время интерфазы, наиболее вероятно через кальций-зависимый липид-связывающий домен

Хотя микросомальная фракция табака BY-2, из которого первоначально был выделен p90 (Marc et al., 1996), также содержит везикулы и эндомембраны, иммунолокализация p90 в кортикальных МТ в призраках протопластов и целых клетках указывает на то, что он действительно ассоциируется с плазмой. мембрана. Некоторые из иммунореактивных точек в контрольных призраках протопластов оказались не прикрепленными к МТ, и многие точки остались связанными с мембраной после деполимеризации МТ Ca ² + и обработки холодом.Напротив, экстракция детергентом удаляла иммунореактивные точки, что соответствовало их предполагаемому прикреплению к липидному бислою. Также оказывается, что p90 может перемещаться латерально внутри плазматической мембраны, на что указывает их перераспределение после обработки таксолом. Предположительно, таксол-индуцированное связывание и переориентация MTs (Kuss-Wymer and Cyr, 1992) сопровождаются соответствующим перераспределением p90.

Принимая во внимание, что p90 ассоциирует не только с кортикальными MT, но также с препрофазной полосой, веретеном и фрагмопластом, кажется вероятным, что p90 способен диссоциировать от плазматической мембраны в начале митоза и повторно присоединяться в конце клеточного деления.Временная ассоциация p90 с мембранами может происходить через домен C2 (Wang, 2000). Домен C2, который присутствует в AtPLD98 и, возможно, также кодируется в соответствующем клоне PLD табака, который еще предстоит секвенировать, вероятно, играет роль в регуляции различных ответов изоформ PLD на Ca ² + (Pappan et al., 1997). Домен C2 также обнаружен во многих белках, которые участвуют во внутриклеточной и межклеточной передаче сигналов, включая цитозольную фосфолипазу A ₂ , фосфолипазу C, UNC-13, синаптотагмин ras-GTPase, рабфилин-3A, белки GAP, протеинкиназу C и перфорин (Ponting, Parker, 1996; Kiyosue, Ryan, 1997).Некоторые белки C2, включая фосфолипазу A ₂ и протеинкиназу C, действительно активируются при контакте с мембранами, что позволяет предположить, что домены C2 могут способствовать перемещению белков между цитозолем и мембранами (Exton, 1994; Wang, 1997).

Возможная роль ассоциации Plasma Membrane – PLD – MT

Появляется все больше доказательств того, что PLDs играют важную роль в регуляции актинового цитоскелета у дрожжей и многоклеточных животных. PLD опосредует образование актиновых стрессовых волокон (Cross et al., 1996), а PLD-опосредованное увеличение фосфатидной кислоты активирует полимеризацию актина в клетках фибробластов (Ha and Exton, 1993). Путь PLD-протеинкиназа C регулирует сборку фокальных точек интегрина и F-актина во время распространения и пролиферации опухолевых клеток (Ghiso et al., 1997). Также известно, что PLD взаимодействует с актинсвязывающими белками, включая гельсолин, который может усиливать активность PLD (Steed et al., 1996), и неэритроидным спектрином, который его ингибирует (Lukowski et al., 1996). Интересно, что МТ-деполимеризующий агент колхицин стимулирует образование актиновых стрессовых волокон в фибробластах (Jung et al., 1997). Однако это не активировало PLD, возможно потому, что сигнальные пути для деполимеризации MT и образования стрессовых волокон разделены (Jung et al., 1997) или стадия активации PLD может быть расположена выше стадии деполимеризации MT.

Хотя различные изоформы PLD были исследованы на растениях (Wang, 1997, 1999, 2000), нет сообщений об ассоциации с MT, что позволяет предположить, что p90 табака и его гомолог Arabidopsis являются специализированными PLD.Интересно, что PLD2 мыши связывается с плазматической мембраной и реорганизует цитоскелет в клетках фибробластов крыс (Colley et al., 1997). У растений организация MT и PLD также могут быть связаны, особенно с учетом того, что стимулы, влияющие на активность PLD, также вызывают реорганизацию MT. Например, ранение вызывает временное, системное Ca ² + -зависимое увеличение мембранно-ассоциированной PLD (Ryu and Wang, 1996), а также повышение фосфатидной кислоты (Lee et al., 1997), а ранение также приводит к к быстрой перестройке МТ (Hush et al., 1990). Сходным образом бактериальная инфекция увеличивает уровни PLD и локализует его на плазматической мембране (Young et al., 1996), а атака патогена также заставляет MTs скапливаться в месте инфекции (Kobayashi et al., 1994). Другая сигнальная связь может включать гормоны растений, которые, как известно, влияют на организацию MT (Shibaoka, 1994). Передача сигналов абсцизовой кислоты в замыкающих клетках устьиц, которая ведет к оттоку K ⁺ , который способствует закрытию устьиц, обеспечивается PLD (Jacob et al., 1999).Абсцизовая кислота также вызывает деполимеризацию МТ в замыкающих клетках устьиц (Jiang et al., 1996), а МТ, в свою очередь, участвуют в открытии замыкающих клеток (Zhou et al., 1999; Huang et al., 2000; Marcus et al., др., 2001). Хотя точная роль MTs в открытии замыкающих клеток неясна (Assmann and Baskin, 1998), было высказано предположение, что этот процесс может вовлекать MT-ассоциированные белки (Marcus et al., 2001). Дальнейшая работа должна показать, выполняет ли табак p90 и его гомолог Arabidopsis эту роль. Интересно, что абсцизовая кислота индуцирует экспрессию другого фермента метаболизма фосфолипидов, фосфатидилинозитол-4-фосфат-5-киназы (Mikami et al., 1998), а активность фосфатидилинозитол-4-киназы ассоциируется с цитоскелетом в протопластах моркови (Xu et al., 1992).

Взаимодействия плазматической мембраны / MT-ассоциированного PLD и его продуктов с другими белками также еще предстоит изучить. Фактор элонгации-1α (EF-1α), который участвует в трансляции белка (Browning, 1996), связывает МТ в присутствии слабых липофильных кислот (Moore and Cyr, 2000) и подвергается протеолизу, опосредованному Ca ² + в присутствие PLDα из клещевины (Ransom-Hodgkins et al., 2000). EF-1α может связывать, связывать, стабилизировать и способствовать сборке MT in vitro (Moore and Cyr, 2000 и ссылки, цитируемые в них), а также он связывает и связывает актин (Liu et al., 1996). Таким образом, EF-1α потенциально может быть эффектором сигналов как для МТ, так и для актинового цитоскелета. Сама PLD активируется различными компонентами сигнальных путей, включая G-белки, кальций, фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат, протеинкиназу C, активируемую фосфолипазой C, и тирозинкиназы (обзор Wang, 1999).Взаимодействие PLD с EF-1α представляет особый интерес, поскольку оно связывает основной генератор вторичных мессенджеров с белком, который вызывает многочисленные клеточные ответы (Browning, 1996).

Совместная локализация PLD с кортикальными MT также может участвовать в нацеливании на вторичные мессенджеры, которые он генерирует, в специфические домены плазматической мембраны (Kondo and Kakiuchi, 1994), таким образом модулируя их функцию. Связанный с мембраной PLD является очевидным кандидатом в качестве якорного белка для MT, хотя трансмембранные белки также задействованы (Akashi and Shibaoka, 1991; Williamson, 1991; Sonesson et al., 1997). Зависимая от клеточного цикла ассоциация PLD с плазматической мембраной может играть роль в высвобождении MTs из плазматической мембраны перед митозом. Интересно, что дрожжевой PLD гомолог SPO14 необходим для мейоза, возможно, благодаря своей способности генерировать мембраны (Rudge et al., 1998). Активность PLD может иметь такое же значение при делении растительных клеток.

Таким образом, открытие уникальной мембранной / MT-ассоциированной PLD открывает захватывающую область, которая связывает сигнальные пути с цитоскелетом.В настоящее время проводятся эксперименты по оценке влияния ингибиторов PLD на организацию массивов MT в растительных клетках.

МЕТОДЫ

Растительный материал

Клетки табака BY-2 ( Nicotiana tabacum Bright Yellow 2) выращивали в суспензии с использованием смеси растительных солей Murashige and Skoog (1962) (ICN Biochemicals, Коста-Меса, Калифорния) с добавлением 2,72 мМ KH ₂ PO ₄ , 1 мг / л тиамина, 0,2 мг / л 2,4-D, 100 мг / л инозита и 3% (мас. / Об.) Сахарозы, pH 5.7. Культуры поддерживали на вращающемся шейкере при 130 об / мин и 25 ° C (Nagata et al., 1981). Клетки пересевали путем переноса 1,5 мл 7-дневной суспензии в 100 мл свежей среды.

Решения

Буфер для плазменной мембраны (PM): 50 мМ Pipes, 1 мМ MgSO ₄ и 1 мМ EGTA, pH 6,8. Буфер для лизиса: 50 мМ Pipes, 2 мМ MgSO ₄ , 2,5 мМ EGTA, 300 мМ сахароза, 5 мМ dl-DTT, 5 мкг / мл каждого из антипаина, лейпептина, химостатина и пепстатина и 25 мкг / мл каждого из фенилметилсульфонилфторид, метиловый эфир Na-бензоил-1-аргинина и метиловый эфир Na- p -тозил-1-аргинина, pH 6.8. Буфер, стабилизирующий микротрубочки (МТ): 50 мМ Pipes, 5 мМ EGTA и 1 мМ MgSO ₄ , pH 6,9. Химические вещества были поставлены Sigma-Aldrich (Castle Hill, Новый Южный Уэльс, Австралия), если не указано иное.

Выделение мембранных белков

Экстракты мембранного белка получали, как описано (Marc et al., 1996). Вкратце, клетки табака BY-2 промывали и ресуспендировали в буфере для лизиса и разрушали взрывной декомпрессией во французском прессе (American Instruments, Silver Spring, MD).Лизат разделяли дифференциальным центрифугированием на микросомальную и цитозольную фракции. Белки экстрагировали из микросомальной фракции путем ресуспендирования осадка в буфере PM с добавлением 10 мМ 3 — ([3-холамидопропил] диметиламино) -1-пропансульфоната (Chaps), 2 мМ DTT и 2 и 10 мкг / мл ингибиторов протеаз, как описанный выше, и инкубировали на льду в течение 50 мин. Нерастворимый в моющем средстве материал осаждали центрифугированием при 48000 g в течение 1-2 часов. Объемные количества солюбилизированных в детергенте мембранных белков замораживали при -80 ° C.

Получение моноклональных антител

Тубулин-связывающих белков из мембранного экстракта Chaps, выделенного тубулиновой аффинной хроматографией (Marc et al., 1996), разделяли с помощью SDS-PAGE и слегка окрашивали водным кумасси бриллиантовым синим R = 250. Полоса 90 кДа была вырезана. вне, и белок был электроэлюирован и диализован для удаления SDS. Мышей BALB / c иммунизировали, и их клетки селезенки сливали с клетками миеломы SP2 / 0-Ag-14 (Harlow and Lane, 1989).Гибридомы подвергали скринингу с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии и иммуноблоттинга, и отобранные линии клонировали путем ограничивающего разведения перед выращиванием до больших объемов. Выбранные антитела включали два обозначенных 4B5 и 6G5. Супернатант культуры с антителом 6G5 концентрировали в 10 раз ультрафильтрацией и переносили в PBS (3 мМ KH ₂ PO ₄ , 7 мМ K ₂ HPO ₄ и 150 мМ NaCl, pH 7,2), содержащий 50% (мас. / Об.) Глицерина.

Анализ совместного оседания

МТ головного мозга крупного рогатого скота были собраны путем смешивания таксола (National Cancer Institute, Bethesda, MD) и чистого тубулина головного мозга крупного рогатого скота в эквимолярных концентрациях при 37 ° C в буфере PM, содержащем 0.5 мМ GTP. Альтернативно, морковные MT получали добавлением таксола к очищенному тубулину моркови (Cyr and Palevitz, 1989) в буфере PM и инкубированием при комнатной температуре. Собранные MT осаждали при 14000 г в течение 15 мин и ресуспендировали в буфере PM с добавлением 10 мкМ таксола.

Таксол добавляли к 200 мкл экстракта табака BY-2 Chaps (от 0,7 до 1,0 мг белка / мл; осветляли центрифугированием при 14000 г в течение 15 минут) до конечной концентрации 10 мкМ перед добавлением 40 мкл 3 мг / мл препарата МТ.Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 10-15 минут, а затем комплексы МТ-белок осаждали при 14000 г в течение 10 минут. Супернатанты и осадок анализировали с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга с антителом 6G5. Для иммунофлуоресцентной микроскопии осадок ресуспендировали в буфере PM, и MT осаждали в течение 20 минут на предметные стекла, которые были предварительно покрыты 0,1% (мас. / Об.) Полиэтиленимином (PEI) и зафиксированы 4% (мас. / Об.) Параформальдегидом в Буфер PM. После промывания PBS препараты обрабатывали для двойного мечения антителом 6G5 и поликлональной сывороткой против α / β-тубулина сои, как и для призраков протопластов (см. Ниже).

Для проверки термостабильности белка массой 90 кДа 200 мкл экстракта табака BY-2 Chaps обрабатывали в течение 10 минут при температурах 25, 45, 60, 70, 80, 90 и 100 ° C. и затем центрифугировали при 14000 g в течение 15 мин. Таксол добавляли к осветленным термообработанным экстрактам Chaps до конечной концентрации 10 мкМ с последующим добавлением 40 мкл препарата МТ, как в анализах совместной седиментации, описанных выше. Осадки анализировали с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга с антителом 6G5.

Приготовление экстрактов белков для электрофореза

проростков арабидопсиса выращивали между двумя листами влажной фильтровальной бумаги в чашке Петри, стоящей на боку. Целые 7-дневные проростки отделяли от кожуры семян, промывали в холодной дистиллированной воде и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с буфером для образцов Laemmli (1970), содержащим ингибиторы протеаз, как описано выше, но без глицерина или бромфенолового синего. Гомогенат центрифугировали при 14000 г в течение 30 минут для удаления твердого материала.Концентрацию белка оценивали с помощью анализа белка Брэдфорда (Bio-Rad) с использованием BSA в качестве стандарта. Образцы белка для электрофореза завершали добавлением глицерина до 10% (мас. / Об.) И бромфенолового синего. Клетки Dictyostelium discoideum (от Маркуса Феххаймера, Университет Джорджии, Афины) промывали, разрушали в стеклянном гомогенизаторе с буфером для образцов Laemmli (1970), содержащим ингибиторы протеаз, как описано выше, кипятили в течение 2 минут и осветляли в центрифуге при 14000 г за 5 мин.

Электрофорез и иммуноблоттинг

Пробы белков разделяли методом SDS-PAGE согласно Laemmli (1970) с использованием 8 или 10% -ных разделяющих гелей. Для иммуноблоттинга разделенные белки переносили электрофоретически на листы из нитроцеллюлозы 0,45 мкм (Bio-Rad) методом Towbin et al. (1979) и сушили на воздухе. Затем листы регидратировали в течение 15 минут с помощью PBS, содержащего 0,05% (об. / Об.) Tween 20, и блокировали в течение 15 минут PBS, содержащим 1% (мас. / Об.) BSA (фракция V; Sigma), 10% (об. / Об.). сыворотка ягненка (Gibco BRL, Helena Laboratories, Глен Уэверли, Виктория, Австралия) и 0.05% (об. / Об.) Твин 20. Блокированные листы инкубировали в течение 1 часа с моноклональным антителом 6G5, разведенным 1:50 или 1: 100 в буфере для разведения (PBS, содержащий 1% [мас. / Об.] BSA, 1% [об. / v] сыворотка ягненка и 0,05% [об. / об.] Твина 20). Конъюгированные с щелочной фосфатазой овцы против IgG мыши (разведенные 1: 1000 в буфере для разведения) использовали в качестве репортерных антител. Блоты проявляли с использованием 20 мМ нитросинего тетразолия и 75 мМ 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата в карбонатном буфере (100 мМ NaHCO ₃ , 50 мМ Na ₂ CO ₃ и 4 мМ MgCl _{. 2} , pH 9.5).

На фиг. 1 белки из экстракта табака BY-2 Chaps были разделены на занавесном геле и перенесены в нитроцеллюлозу, как описано выше. Полоски нитроцеллюлозы инкубировали с антителами (все в буфере для разведения) против следующих веществ: α-тубулин (1: 100; Amersham), γ-тубулин (1: 1000; Dibbayawan et al., 1995), α / β- сои. тубулин (1: 400) и антитело 6G5 (1: 100). Для контроля антитело 6G5 перед использованием нагревали при 80 ° C в течение 10 мин.

Образцы белков для микросеквенирования по деградации по Эдману были получены из тубулин-связывающих белков из мембранного экстракта Chaps, выделенного с помощью тубулин-аффинной хроматографии (Marc et al., 1996). Белки разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на поливинилидендифторидную мембрану для секвенирования (Millipore, Bedford, MA) с использованием буфера для переноса 3- [циклогексиламино] -1-пропансульфоновой кислоты. Белки на мембране окрашивали кумасси бриллиантовым синим R = 250, и полосу 90 кДа вырезали для анализа в Applied Biosystems (Hershey, PA) 473A Protein Sequencer.

Получение протопластов, мембранных призраков и целых клеток

Протопласты получали из 5- или 6-дневных клеток табака BY-2 путем переваривания клеточных стенок 1% (мас. / Об.) Целлюлазы Y-C и 0.1% (мас. / Об.) Пектолиазы Y-23 (Seishin Corporation, Токио, Япония) в 450 мМ манните с добавлением 0,5% (мас. / Об.) BSA, pH 5,4. Некоторые протопласты были получены из клеток, которые были предварительно обработаны в течение 30 минут 10 мкМ таксола, добавленным в культуральную среду перед стадией переваривания. После ферментного расщепления протопласты дважды промывали промывочным буфером (10 мМ Pipes, 285 мМ маннита и 100 мМ KCl, pH 6,8) и осаждали на 12-луночных предметных стеклах, покрытых PEI (ICN Biochemicals, Aurora, OH), на 15 мин. . Затем протопласты лизировали, взмахивая предметным стеклом, чтобы получить призраков протопластов, и фиксировали 4% (мас. / Об.) Параформальдегидом в MT-стабилизирующем буфере в течение 30 мин.Фиксированных призраков промывали PBS, сушили на воздухе в течение 15 минут и регидратировали PBS.

Целые клетки табака BY-2 (возраст 5 или 6 дней) помещали на предметные стекла, покрытые PEI, на 30 мин и фиксировали в течение 30 мин 4% (мас. / Об.) Параформальдегидом в MT-стабилизирующем буфере с добавлением 1% (об. / v) ДМСО и 0,05% (об. / об.) Triton X-100. Затем препараты промывали PBS, расщепляли в течение 2 мин смесью ферментов, как и протопласты, снова промывали PBS, сушили на воздухе и регидратировали PBS.

Иммунофлуоресцентная микроскопия

Фиксированные призраки протопластов и целые клетки, прикрепленные к многолуночным предметным стеклам, подвергали проницаемости метанолом при -20 ° C в течение 5 минут, регидратировали с помощью PBS и инкубировали с антителами, разведенными в PBS, содержащем 1% (мас. / Об.) BSA и 0.02% (мас. / Об.) Triton X-100 в течение 1 часа при комнатной температуре. Для двойного мечения мы использовали моноклональное антитело 6G5 (разведенное 1:50) или моноклональное антитело 4B5 (супернатант культуры, чистый) вместе с поликлональной сывороткой против α / β-тубулина сои (разведенное 1:50 для призраков протопластов и 1: 200 для цельного ячеек). Материал промывали PBS и инкубировали в течение 1 часа во вторичных антителах овец против IgG кролика, конъюгированных с Cy3 (Sigma) и конъюгированных с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) (Silenus, Amrad Operations, Борония, Виктория, Австралия). (разводят 1: 500 и 1:30 соответственно).Контроли без одного или обоих первичных антител были отрицательными. После промывания PBS препараты окрашивали 1 мкг / мл 4 ‘, 6-диамидин-2-фенилиндола дигидрохлорида в PBS и помещали в среду Citifluor AF2 (Alltech Associates, Baulkham Hills, Новый Южный Уэльс, Австралия). Контроли с одиночными флуорохромами не показали значительного спектрального перекрытия (просачивания) между FITC и Cy3 при использовании нашего оборудования.

Материал просматривали с помощью микроскопа Zeiss Axiophot, оснащенного стандартной эпифлуоресцентной оптикой (Carl Zeiss, Оберкохен, Германия), и фотографировали с использованием пленки Kodak T-Max при 400/27 ISO.В качестве альтернативы материал просматривали с помощью микроскопа Olympus Provis AX70 (Olympus Optical Co. Ltd., Токио, Япония), оснащенного эпифлуоресцентной оптикой и системой сбора / деконволюции (Scanalytics, Fairfax, VA). Изображения были получены с помощью охлаждаемой камеры устройства с зарядовой связью (Photometrics Sensys, Tucson, AZ) и распечатаны на принтере Epson 800 (Epson Pty. Ltd., Сидней, Новый Южный Уэльс, Австралия) или сублимационном принтере NP-1600M ( Codonics, Мидлбург-Хайтс, Огайо).

Скрининг библиотеки кДНК Arabidopsis

Escherichia coli XL-1 Blue MRF ‘(Stratagene) добавляли к 3000-4000 бляшкообразующих единиц библиотеки кДНК Arabidopsis λZap II (CD4-16; Arabidopsis Biological Resource Center, Колумбус, Огайо), смешанных с верхним агар и равномерно распределить по каждой 150-мм чашке с агаровой средой Лурия-Бертани и инкубировать при 42 ° C в течение 4 часов (Sambrook et al., 1989). Нитроцеллюлозные фильтры Hybond-C (Amersham), предварительно пропитанные 10 мМ изопропилтио-β-галактозидом, помещали на колонии бактериофагов на каждом планшете и инкубировали при 37 ° C в течение 4 часов. Затем фильтры промывали 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, содержащим 150 мМ NaCl (трис-буферный солевой раствор [TBS]) и 0,05% (об. / Об.) Твин 20 (TBST), инкубировали в течение 1 часа с любым антителом 6G5. разбавленным 1: 100 или моноклональным анти-α-тубулином (B512, Sigma), разведенным 1: 2000, промытым TBST и инкубированным с моноклональными овечьими антимышиными антителами, конъюгированными с щелочной фосфатазой (Silenus), разведенными 1: 1000.После промывания TBST, а затем TBS, фильтры проявляли 20 мкМ нитросинего тетразолия и 75 мкМ 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата в субстратном буфере (100 мМ трис-HCl, pH 9,5, содержащий 100 мМ NaCl и 5 мМ MgCl ₂ ). Положительные бактериофаговые бляшки вырезали и титровали перед вторичным и третичным скринингом при более высоких разведениях антител, и из каждой чашки отбирали колонию для получения исходных глицериновых растворов (Sambrook et al., 1989).

Иссечение вставок in vivo выполняли в соответствии с инструкцией ExAssist Interference-Resistant Helper Phage со штаммом SOLR (Stratagene).Вкратце, запасы выбранных бактериофаговых бляшек смешивали с клетками XL1-Blue MRF ‘и вспомогательным фагом ExAssist (Stratagene), выращивали в бульоне Лурия-Бертани, и кратковременно нагревали при 65-70 ° C, и остатки центрифугировали. Супернатант инкубировали с клетками SOLR, и клетки, содержащие фагмиды, выращивали в течение ночи на чашках Luria-Bertani при отборе ампициллина (50 мкг / мл). Клон метки экспрессированной последовательности, содержащий кДНК полной фосфолипазы D (PLD) (номер доступа в GenBank W43825; Newman et al., 1994) был получен из Центра биологических ресурсов арабидопсиса.

Выделение плазмид, секвенирование и анализ последовательностей

Стандартное выделение плазмиды (Sambrook et al., 1989) было немного изменено следующим образом: 40 мкг РНКазы было добавлено перед стадией экстракции, которую проводили последовательно с фенолом, фенолом / хлороформом и хлороформом / изоамиловым спиртом (24: 1). . Затем осажденные плазмиды растворяли в 20 мкл воды. Первоначально для секвенирования использовались праймеры Т3 и Т7, а затем другие праймеры, предназначенные для секвенирования целых клонов.Химическое секвенирование красителя-терминатора с использованием секвенатора ABI 373A (Applied Biosystems, La Jolla, CA) было выполнено в SUPAMAC (Сиднейский университет, Новый Южный Уэльс, Австралия). Согласованная последовательность была получена из этих прогонов секвенирования с использованием программного обеспечения SEQUENCHER (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI). Сходство последовательностей было проанализировано с помощью поисковой машины BLAST (Altschul et al., 1990) в Национальном центре биотехнологической информации (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) и нескольких выравниваний с использованием CLUSTAL W (Thompson et al. al., 1994) в Pole Bioinformatique Lyonnais (http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalwan.html).

Иммунопреципитация

Белковые экстракты получали из 3–5-дневных клеток табака BY-2. Клетки лизировали с использованием французского пресса, как описано ранее (Marc et al., 1996), и лизат центрифугировали в течение 10 мин при 4000, g, и 4 ° C. Затем супернатант инкубировали с 10 мМ Chaps в буфере для лизиса на льду в течение 30-50 минут для экстракции мембранных белков и осветляли при 200000 г при 4 ° C в течение 20 минут.Иммунопреципитацию проводили согласно Harlow and Lane (1989) со следующими модификациями. Образцы белка (1 мг / мл) смешивали с буфером для иммунопреципитации (20 мМ Трис-HCl, 1 мМ EGTA, 1 мМ MgCl ₂ , 10 мМ Chaps, 1 мМ DTT и смесь ингибиторов протеазы [Boehringer Mannheim, Roche Molecular Biochemicals , Indianapolis, IN], pH 7,5) с получением реакционного объема 100 мкл. Добавляли первичные антитела, и смесь инкубировали на льду в течение 1 часа с последующим добавлением 10 мкл суспензии вторичных конъюгатов антитело-агароза и дальнейшей инкубацией в течение 30-60 минут.В качестве первичных антител мы использовали антитело 6G5 (IgM; 10 мкл супернатанта гибридомы), мышиный моноклональный клон анти-α-тубулина DM1A (IgG1; Sigma; 1 мкл асцита), мышиный моноклональный анти-актиновый клон 3h21 (IgG; 10 мкл). супернатанта гибридомы) и мышиный моноклональный клон 1D10 против кальмодулина (IgG; 10 мкл супернатанта гибридомы). Для вторичных антител мы использовали козий иммуноглобулин против мышиного IgM, конъюгированного с агарозой (Sigma), или козий иммуноглобулин против мышиного IgG, конъюгированного с агарозой (Sigma).

После инкубации с антителами реакционную смесь покрывали слоем ~ 100 мкл 50% сахарозы в буфере для иммунопреципитации, и агарозо-иммунный комплекс осаждали в микроцентрифуге при 400 g в течение 1 мин.Супернатант аспирировали, сахарозную подушку осторожно удаляли и осажденные агарозо-иммунные комплексы ресуспендировали в 13 мкл буфера для иммунопреципитации.

Анализ PLD

PLD проводили с использованием иммунопреципитированных образцов или белковых фракций из тубулин-аффинной хроматографии (Marc et al., 1996). Образец белка (от 2 до 20 мкл) добавляли к общему реакционному объему 80 мкл, содержащему 50 мМ Mes, pH 6,5, 5 мМ MgCl ₂ , 100 мкМ CaCl ₂ , 1.5% (об. / Об.) Этанола и смеси фосфолипидов, приготовленной с удвоенной концентрацией, дающей конечные концентрации 140 мкМ 7-нитробенз-2-окса-1,3-диазол-конъюгированный фосфатидилхолин, 200 мкМ фосфатидилэтаноламин (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) и 30 мкМ фосфатидилинозитолбисфосфата (Sigma). Реакции проводили в течение 20 мин при комнатной температуре при встряхивании со скоростью 100 об / мин. Реакции анализа останавливали добавлением 300 мкл хлороформа: метанола (1: 2), после чего добавляли 80 мкл хлороформа и 80 мкл 2 М KCl.Липиды экстрагировали и разделяли с помощью тонкослойной хроматографии, и флуоресценцию фосфатидилэтанола определяли количественно, как описано ранее (Ritchie and Gilroy, 1998).

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим Джанет Эллиот (Исследовательская школа биологических наук Австралийского национального университета, Канберра) за ее экспертную помощь в производстве моноклональных антител, Николу Янг (Университет Сиднея) за подготовку анализов совместной оседания и иммуноблотов, доктора Сейитиро Хаседзава (Университет г. Tokyo) за любезно предоставленную культуру клеток табака BY-2, Dr.Маркусу Феххаймеру (Университет Джорджии, Афины) за предоставленный образец Dictyostelium и доктору Кенту Чепмену (Университет Северного Техаса, Дентон) за то, что он поделился с нами неопубликованной последовательностью PLD табака. Таксол был щедрым подарком от Отделения синтеза лекарств и химии Отделения лечения рака Национального института рака (Бетесда, Мэриленд). Эта работа была поддержана конкурсными исследовательскими грантами A105 и A19700148 от Австралийского исследовательского совета для J.M. и австралийской премией для аспирантов J.К.Г.

ССЫЛКИ

Акаси Т. и Сибаока Х. (

1991

J. Cell Sci.

98

169

Акаси Т., Кавасаки С. и Сибаока Х. (

1990

Планта

182

363

Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W., и Lipman, D.J. (

1990

J. Mol. Биол.

215

403

Asada, T. и Collings, D. (

1997

Trends Plant Sci.

2

29

Ассманн, С.М., Баскин, Т.И. (

1998

J. Exp. Бот.

49

163

Barroso, C., Chan, J., Allan, V., Doonan, J., Hussey, P., and Lloyd, S. (

2000

Завод Дж.

24

859

Блэкман, Л. М., и В целом, Р. Л. (

1995

Протоплазма

189

256

Браунинг, К.С. (

1996

Завод Мол. Биол.

32

107

Burk, D.H., Liu, B., Zhong, R., Morrison, W.H., and Ye, Z.-H. (

2001

Растительная клетка

13

807

Cai, G., Romagnoli, S., Moscatelli, A., Ovidi, E., Bambellini, G., Tiezzi, A., and Cresti, M. (

2000

Растительная клетка

12

1719

Чан, Дж., Дженсен, К.Г., Дженсен, Л.К.У., Буш, М., и Ллойд, К.В. (

1999

Proc. Natl. Акад. Sci. США

96

14931

Chapman, K.D. (

1998

Trends Plant Sci.

3

419

Колли, В.С., Сунг, Т.-К., Ролл, Р., Дженко, Дж., Хамонд, С.М., Альтшуллер, Ю., Бар-Саги, Д., Моррис, А.Дж., и Фроман, М.А. (

1997

Curr.Биол.

7

191

Кросс, М.Дж., Робертс, С., Ридли, А.Дж., Ходжкин, М.Н., Стюарт, А., Клаэссон-Уэлш, Л., и Вакелам, М.Дж.О. (

1996

Curr. Биол.

6

588

Cyr, R.J. (

1994

Annu. Rev. Cell Biol.

10

153

Cyr, R.J., и Palevitz, B.A. (

1989

Планта

177

254

Cyr, R.J., и Palevitz, B.A. (

1995

Curr.Opin. Cell Biol.

7

65

Диббаяван Т.П., Харпер Дж.Д.И., Эллиотт Дж. Э., Ганнинг Б.Э.С. и Марк Дж. (

1995

Cell Biol. Int.

19

559

Дюбуа, Ф., Ха, Д. Б. Д., Сангван, Р. С., и Дюран, Дж. (

1996

Завод Дж.

10

47

Durso, N.A., and Cyr, R.J. (

1994

Растительная клетка

6

893

Durso, N.A., Leslie, J.D., and Cyr, R.J. (

1996

Протоплазма

190

141

Exton, J.H. (

1994

Биохим. Биофиз. Акта

1212

26

Фишер, Д.Д., Сир, Р.Дж. (

1998

Plant Physiol.

116

1043

Fosket, D.E., and Morejohn, L.C. (

1992

Annu. Rev. Plant Physiol. Завод Мол. Биол.

43

49

Голуэй, М.Э., Хардхэм А. (

1986

Протоплазма

135

130

Гертель, Э. Т., и Грин, П. Б. (

1977

Plant Physiol.

60

247

Ghiso, J.A.A., Farias, E.F., Alonso, D.F., Arregui, C., and Joffe, E.B.D. (

1997

Внутр. J. Рак

71

881

Giddings, T.H., Jr., and Staehelin, L.A. (1991). Микротрубочки-опосредованный контроль отложения микрофибрилл: повторное рассмотрение гипотезы.В «Цитоскелетные основы роста и формы растений», C.W. Lloyd, ed (Лондон: Academic Press), стр. 85–99.

Грейнджер, К.Л., Сир, Р.Дж. (

2001

Протоплазма

216

201

Gunning, B.E.S., и Hardham, A.R. (

1982

Annu. Rev. Plant Physiol.

33

651

Ха, К.-С., Экстон, Дж. Х. (

1993

J. Cell Biol.

123

1789

Харлоу, Э.и Lane D. (1989). Антитела: лабораторное руководство. (Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Лаборатория Колд-Спринг-Харбор Пресс).

Хуанг, Р.Ф., Ван, X.C., и Лу, C.H. (

2000

Plant Sci.

156

65

Hugdahl, J.D., Bokros, C.L., and Morejohn, L.C. (

1995

Растительная клетка

7

2129

Hush, J.M., and General, R.L. (

1991

Cell Biol. Int. Реп.

15

551

Hush, J.M., Hawes, C.R., and General, R.L. (

1990

J. Cell Sci.

96

47

Джейкоб Т., Ричи С., Ассманн С.М. и Гилрой С. (

1999

Proc. Natl. Акад. Sci. США

96

12192

Цзян С.-Дж., Накадзима Н. и Кондо Н. (

1996

Physiol.

37

697

Юнг, Х.И., Шин, И., Пак, Ю.М., Кан, К.В., и Ха, К.С. (

1997

Мол. Ячейки

7

431

Киесуэ, Т., и Райан, К.А. (

1997

Завод Мол. Биол.

35

969

Кобаяши И., Кобаяши Ю., Хардхэм А. (

1994

Планта

195

237

Кондо Т. и Какиучи Т. (

1994

Тонкие сплошные пленки

244

887

Кост, Б., Матур, Дж., И Чуа, Н.-Х. (

1999

Curr. Opin. Plant Biol.

2

462

Кришнакумар, С., Оппенгеймер, Д.Г. (

1999

Девелопмент

126

3079

Кусс-Ваймер, К.Л., Сир, Р.Дж. (

1992

Протоплазма

168

64

Лаеммли, Великобритания (

1970

Природа

227

680

Laskowski, M.J. (

1990

Планта

181

44

Ли, С., Сух, С., Ким, С., Крейн, Р.С., Квак, Дж. М., Нам, Х.-Г. и Ли, Ю. (

1997

Завод Дж.

12

547

Лю Б., Джоши Х.С., Уилсон Т.Дж., Силфлоу К.Д., Палевиц Б.А. и Снустад Д.П. (

1994

Растительная клетка

6

303

Лю Дж., Тан Дж., Эдмондс Б. Т., Мюррей Дж., Левин С. и Кондилис Дж. (

1996

J. Cell Biol.

135

953

Ллойд, К.W., изд (1991). Цитоскелетная основа роста и формы растений. (Лондон: Academic Press).

Ллойд, К.В., Слабас, А.Р., Пауэлл, А.Дж., и Лоу, С.Б. (

1980

Планта

147

500

Луковски С., Леконт М.-К., Мира Ж.-П., Марин П., Гаутеро Х., Руссо-Мари Ф. и Джени Б. (

1996

J. Biol. Chem.

271

24164

Марк Дж., Шарки Д. Э., Дюрсо Н. А., Чжан М. и Сир Р. Дж. (

1996

Растительная клетка

8

2127

Маркус, А.И., Мур, Р.С., и Сир, Р.Дж. (

2001

Plant Physiol.

125

387

Мелан М.А. и Слудер Г. (

1992

J. Cell Sci.

101

731

Миками К., Катагири Т., Юти С., Ямагути-Шинозаки К. и Шинозаки К. (

1998

Завод Дж.

15

563

Мур, Р.С., и Сир, Р.Дж. (

2000

Cell Motil. Цитоскелет

45

279

Мурашиге Т. и Скуг Ф. (

1962

Physiol. Растение.

15

473

Нагата Т., Окада К., Такебе И. и Мацуи К. (

1981

Мол. Genet Genet.

184

161

Ньюман, Т., деБрюйн, Ф.Дж., Грин, П., Кигстра, К., Кенде, Х., Макинтош, Л., Олрогге, Дж., Райхель, Н., Сомервилль, С., Томасшоу, М., Retzel, E., and Somerville, C. (

1994

Plant Physiol.

106

1241

Ник, стр. (

1999

Plant Biol.

1

169

Ник П., Бергфельд Р., Шафер Э. и Шопфер П. (

1990

Планта

181

162

Ник П., Хойинг А. и Эманн Б. (

2000

Протоплазма

211

234

Палият, Г., и Дройлард, М.Дж. (

, 1992,

Биохимия растений. Physiol.

30

789

Паппан К., Чжэн С. и Ван Х. (

1997

J. Biol. Chem.

272

7048

Петрасек, Дж., Фройденрайх, А., Хойинг, А., Опатрни, З., и Ник, П. (

1998

Протоплазма

202

161

Понтинг, К.П., Керр, И.Д. (

1996

Protein Sci.

5

914

Ponting, C.P. и Parker, P.J. (

1996

Protein Sci.

5

162

Рэнсом-Ходжкинс, W.D., Brglez, I., Wang, X., and Boss, W.F. (

2000

Plant Physiol.

122

957

Ричи С. и Гилрой С. (

1998

Proc. Natl. Акад. Sci. США

95

2697

Радж, С.А., Моррис, А.Дж., и Энгебрехт, Дж. (

1998

J. Cell Biol.

140

81

Рю, С.Б. и Ван Х. (

1996

Биохим. Биофиз. Акта

1303

243

Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Молекулярное клонирование: лабораторное руководство. (Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Лаборатория Колд-Спринг-Харбор Пресс).

Shibaoka, H. (

1994

Annu. Rev. Plant Physiol. Завод Мол. Биол.

45

527

Simmonds, DH (

1992

Physiol. Растение.

85

387

Смертенко А., Салех Н., Игараси, Х., Мори, Х., Хаузер-Хан, И., Цзян, К.-Дж., Сонобе, С., Ллойд, К.В., и Хасси, П.Дж. (

2000

Nat. Cell Biol.

2

750

Smith, H.M.S., и Raikhel, N.V. (

1998

Растительная клетка

10

1791

Смит, Л.Г., Герттула, С.М., Хан, С., и Леви, Дж. (

2001

J. Cell Biol.

152

231

Sonesson, A., Berglund, M., Staxen, I., and Widell, S. (

1997

Plant Physiol.

115

1001

Sonobe, S. и Takahashi, S. (

1994

Physiol растительных клеток.

35

451

Стид П.М., Нагар С. и Венногл Л. (

1996

Биохимия

35

5229

Стоппин-Меллет В., Питер К., Ламберт А.М. (

2000

Plant Biol.

2

290

Томпсон, Дж. Д., Хиггинс, Д. Г., Гибсон, Т. Дж. (

1994

Nucleic Acids Res.

22

4673

Torres-Ruiz, R.A., and Jurgens, G. (

1994

Девелопмент

120

2967

Towbin, H., Staehelin, T., and Gordon, J. (

1979

Proc. Natl. Акад. Sci. США

76

4350

Traas, J., Bellini, C., Nacry, P., Kronenberger, J., Bouchez, D., and Caboche, M. (

1995

Природа

375

676

Веск П.А., Веск М., Ганнинг Б.Е.С. (

1996

Протоплазма

195

168

Ван, Х. (

1997

Trends Plant Sci.

2

261

Ван, Х. (

1999

Plant Physiol.

120

645

Ван, X. (

2000

Прог. Lipid Res.

39

109

Whittington, A.T., Vugrek, O., Jun Wei, K., Hasenbein, N.G., Sugimoto, K., Rashbrooke, M.C., and Wasteneys, G.O. (

2001

Природа

411

610

Уильямсон, Р. (

1991

Внутр. Rev. Cytol.

129

135

Wymer, C.L., и Lloyd, C.W. (

1996

Trends Plant Sci.

1

222

Ваймер, К.Л., Ваймер, С.А., Косгроув, Д.Дж., Сир, Р.Дж. (

1996

Plant Physiol.

110

425

Xu, P., Lloyd, C.W., Staiger, C.J., and Drobak, B.K. (

1992

Растительная клетка

4

941

Янг, С.А., Ван, X. и Лич, Дж. Э. (

1996

Растительная клетка

8

1079

Зандомени К. и Шопфер П. (

1994

Протоплазма

182

96

Zhou, X.M., Wu, W.H., Yuan, M., and Wang, X.C. (

1999

Подбородок. Sci. Бык.

44

919

Заметки автора

© 2001 Американское общество биологов растений

Эта статья публикуется и распространяется на условиях Oxford University Press, Standard Journals Publication Model (https: // Academic.